實驗一培養(yǎng)基的配制及滅菌

實驗一 培養(yǎng)基的配制及滅菌培育基是人工配制的適合微生物生長生殖或積存代謝產物的養(yǎng)分基質，用以培育、分別、鑒定、保存各種微生物或積存代謝產物。各類微生物對養(yǎng)分的要求不盡一樣，因而培育基的種類繁多。在這些培育基中，就養(yǎng)分物質而言，一般不外乎碳源、氮源、無機鹽、生長因子及水等幾大類。培育基的配制，一是要求在養(yǎng)分成分上能滿足所培育微生物生長發(fā)育的需要，二是培育基在使用前不帶菌，三是以滅菌后和保存過程中養(yǎng)分成分不發(fā)生變化。培育或活的生物殘體，保證培育基在貯存過程中不變質，也防止其他生物對培育的污染。一、試驗目的?把握試驗室常用玻璃器皿的清洗、枯燥和包扎方法。把握配制培育基的一般方法和步驟。。二、試驗原理滅菌是指殺滅物體中全部微生物的生殖體和芽孢的過程。消毒是指用物理、化學或生物的方法殺死病原微生物的過程。滅菌的原理就是使蛋白質和核酸等生物大分子發(fā)生變性，從而到達滅菌的作用，試驗室中最常用的就是干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而到達滅菌的目的。細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環(huán)因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高16～17℃，時間長1～2h?18甚至引起燃燒。熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，連續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而到達滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其緣由有三：一是濕熱中細菌菌體吸取水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大，三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。這種潛熱，能快速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。培育基是人工配制的適合微生物生長生殖或積存代謝產物的養(yǎng)分基質，LB?I?號培育基，培育霉菌常用蔡氏培育基或馬鈴薯葡萄糖培育基PD，培育酵母菌常用麥芽汁培育基或馬鈴薯葡萄糖培育基PD。依據培育目的不同，可分為固體培育基和液體培育基；此外，還有加富、選擇、鑒別等培育基之分。就培育基中的養(yǎng)分物質而言，一般不外乎碳源、氮源、無機鹽、生長因子及水等幾大類。瓊脂〔Agar〕只而在?45℃左右開頭凝固成固體。在配制培育基時，依據各類微生物的特點，就可以配制出適合不同種類微生物生長發(fā)育所需要的培育基。培育基除了滿足微生物所必需養(yǎng)分物質外，還要求有確定的酸堿度和滲透壓。霉菌和酵母菌的?pH?偏酸；細菌、放線菌的?pH都要將培育基的?pHLB培育基配方pH7.：胰蛋白胨〔Tryptone〕 10.0g酵母提取物〔Yeastextract〕 5.0g氯化鈉〔NaCl〕 10.0g瓊脂粉〔Agar〕? 20.0g5mol/LNaOH調pH7.0，用去離子水定容1L，0.1MPa20min。牛肉膏蛋白胨培育基配方pH?7.：牛肉膏? 3.0g?胰蛋白胨〔Tryptone〕 10.0g?NaCl 5.0g?瓊脂粉〔Agar〕?20.0g去離子水?1000mL??I號培育基配方pH7.4-7.：可溶性淀粉? 20.0g?NaCl??? 0.5g?KNO

? 1.0g?3KHPO2

?3H4

O??? 0.5g?2MgSO

?7HO???? 0.5g?4 2FeSO

?7HO???? 0.01g?4 2瓊脂粉〔Agar〕 20.0g?去離子水 1000mL??馬鈴薯培育基配方〔?p：馬鈴薯〔去皮〕? 200.0g?葡萄糖〔或蔗糖Dextroseorglucose〕20.0瓊脂粉〔Agar〕 20.0g?去離子水 1000mL?察氏培育基配方〔?p：蔗糖〔glucose〕? 30.0g?NaNO? 2.0g?3KHPO2

? 1.0g?4KCl???? 0.5g?MgSO

?7HO???? ? 0.5g?4 2FeSO

?7HO????? 0.01g?4 2瓊脂粉〔Agar〕 20.0g?去離子水? 1000mL?YPD培育基配方pH7.：酵母提取物〔Yeastextract〕10.0g蛋白胨〔Peptone〕20.0g葡萄糖或蔗糖〔Dextroseorglucose〕 20.0g瓊脂粉〔Agar〕? 20.0g去離子水? 1000mL?0.1MPa20min。三、試驗材料牛肉膏蛋白胨、高氏?ILB、PDA、YPD、察氏等各種培育基。四、儀器設備及用具90mmpH?試紙〔pH?5.9.、記號筆、麻繩、紗布等；培育基分裝器、天平、電磁爐、微波爐、電爐、石棉網、電熱鼓風枯燥箱、立式高壓蒸汽滅菌鍋。五、試劑無水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、馬鈴薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨〔Pepton、胰蛋白胨Trypton、酵母提取物YeastextracNaC、5mol/LNaOH1mol/LHClKNOK

HPO

?3H

?7H

?7HO等。六、試驗步驟1．洗滌

3 2 4 2 4 2 4 2用試管刷蘸取少量去污粉反復刷洗器皿2～3次；用自來水沖洗2～31～2留意事項：2%②用過的器皿應馬上洗滌。必需到在廢物缸內。④洗滌后的器皿應到達玻璃壁能被水均勻潮濕而無條紋和水珠。2．器皿包扎5〔或依據需要而定疊在一起，用結實的紙卷成一筒，或裝入特制的不銹鋼桶中，然后進展滅菌。吸管：洗凈，烘干后的吸管，在吸口的一頭塞入少許脫脂棉花，以防在使用時造成污染。塞入的棉花量要適宜，多余的棉花可用酒精燈火焰燒4～5cm30～50℃的角度螺旋形卷起來，吸管的尖端在頭部，另一端用剩余的紙條打成一結，以防散開，標上容量，試管和三角瓶：試管和三角瓶都需要做適宜的棉塞，棉塞可起過濾作用，避開空氣中的微生物進入容器。制作棉塞時，要求棉花緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙，松緊適宜。過緊易擠破管口和不易塞入；過松易掉落和污染。棉塞的長度不小于管口直徑的22/3扎在一起，在棉花部格外包裹油紙或牛皮紙，再用繩扎緊。三角瓶加棉塞后單個用報紙包扎。烘干洗凈的儀器控去水分，放在烘箱內烘干，烘箱溫度為105～110℃烘1小時左右。此法適用于一般儀器。對于急于枯燥的儀器或不適于放入烘箱的較大的儀器可用吹干的方法。通常用少量乙醇、丙酮〔或最終再用乙醚〕倒入已控去水分的儀器中搖洗，然后用電吹風機吹至完全枯燥。不急等用的儀器，可在蒸餾水沖洗后在無塵處倒置處控去水分，然后自然枯燥?？捎冒灿心踞數募茏踊驇в型笟饪椎牟ＡЧ穹胖脙x器。培育基的配置牛肉膏蛋白胨培育基A、稱量按培育基配方比例依次推確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL也可按在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如略微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分別，然后馬上取出紙片。一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯。?B、溶化在上述燒杯中先參與少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解。將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積，假設配制固體培育基時，將稱好的瓊脂放入己溶的藥品中，再加熱溶化，最終補足所損失的水分。C、調整?pH?在未調?pH?pHpH，假設偏酸，用滴管向培育基中逐滴參與?1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用?pH試紙測其?pH?pH?7.6?1mol/LHCL?pH較準確的微生物，其?pH?pH?不要調過頭，以避開回調而影響培育基內各離子的濃度。配制?pH好?pH?并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。?D、過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些試驗結果的觀看。一般無特別要求的狀況下可以省去〔本試驗勿需過濾。?E、分裝〔見圖3-a?l/4依據需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，假設是用于振蕩培育用，則依據通氣量的要求酌情減?圖?1-1?培育基的分裝A?漏斗分裝裝置；B?自動分裝裝置。漏斗；3；4；5；67?裝量調整；8少；有的液體培育基在滅菌后，需要補加確定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量確定要準確。??1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。?c?1/3分裝過程中，應留意不要使培育基沾在管〔瓶〕口上，以免沾污棉塞而引起污染。?F、加塞培育基分裝完畢后，在試管口或三角烷瓶口上塞上棉塞〔或硅膠塞及試管帽等，棉塞的作用有二：一方面阻擋外界微生物進入培育基，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使培育在里面的微生物能有著很大的影響。一只好的棉塞，外形應象一只蘑菇，大小、松緊都應適當〔見圖3-?3/52/5在口外。G、包扎

1-2?棉塞的制作加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培育基名稱、組別、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時簡潔解開，同樣用記號筆注明培育基名稱、組別、配制日期。高氏IA、稱量和溶化：按配方先稱取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調成糊狀，再參與少于所需水量的沸水中，連續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后再稱取其他各成分依次逐一溶化。對微量成分?FeSO?7H

O?可先配成高濃度的貯備液按比例換算后再參與，方法是先4 2?FeSO

?7H4

2中加?1mL?0.0lg/mL所需的總體積。如要配制固體培育基，其溶化過程同牛肉膏蛋白胨培育基配制方法。?BpH、分裝、包扎：滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培育基配制方法。LB〔Yeastextract〕5g，氯化鈉〔NaCl〕10g15～20g5mol/LNaOH調pH滅菌?20?min。馬鈴薯培育基配制〔PDA〕用玻棒攪拌以防糊底。然后用雙層紗布過濾，取濾液加糖〔酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖，加熱煮沸后參與瓊脂，連續(xù)加熱溶化并補足失水。再按前所述，進展分裝、加塞、包扎、0.1MPa?20?min。?察氏培育基配制方法同牛肉膏蛋白胨培育基配制。YPD方法同LB滅菌?高壓蒸氣滅菌A、首先將內層鍋取出，再向外層鍋內參與適量的去離子水，使水面與三角擱架相平為宜。?B、放回內層鍋，并裝入待滅菌物品〔各種玻璃器皿、培育基等。留意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果，三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透人棉塞。C、加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺拴，使螺栓松緊全都，勿使漏氣。?D、通電加熱，并同時翻開排氣閥，使水沸騰5min，以排解鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上徘氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸氣壓力增加而漸漸上升。當鍋內壓力升到所得壓力時，把握熱源，維持壓力至所需時間。E、滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至“0”時，翻開排氣閥，旋松螺栓，翻開蓋子，取出滅菌物品。干熱滅菌A、裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品〔培育皿、試管、吸管等〕放入電烘箱內，關好箱門。?B、升溫接通電源，撥動開關，翻開電烘箱排氣孔，旋動恒溫調整器至綠燈亮，100℃時，關閉排氣孔。在升溫過程中，假設160～170℃溫度，則需轉動調整器使紅燈再亮，如此反復調整，直至到達所需溫度。C、恒溫160～1702h。D、降溫切斷電源、自然降溫。E、開箱取物70℃以下后，翻開箱門，取出滅菌物品。無菌撿查37℃24～48h，以檢查滅菌是否徹底。留意事項：180℃以上時，簡潔焦化起火，所以干熱滅菌的溫度180℃；由于油紙在高溫