包含體純化步驟(精)

學(xué)習(xí)文檔僅供參考學(xué)習(xí)文檔僅供參考學(xué)習(xí)文檔僅供參考學(xué)習(xí)文檔僅供參考同樣采用Ni-NTAHis結(jié)合樹脂親和純化重組目的蛋白，1、200mL菌液離心收集大量誘導(dǎo)的菌體，并用1XPBS緩沖液洗滌兩次。2、將保存的菌體沉淀用總體積為20mL的IXBindBuffer(300mMNaCl,50MmNaHPO4;210mMimidazote)重懸，在冰浴中超聲波破菌至溶液呈白色澄清。3、4℃12,000rpm離心30分鐘，然后用20mL的包涵體洗滌Buffer(50mmol/LTris-HCl,100mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA,0.5%Tritonx-100,pH8.0)洗滌沉淀兩次。4、加20mL的包涵體溶解Buffer〔50mmol/LTris-HCl,100mmol/LNaCl,8mol/LUrea,pH8.0〕充分溶解，〔旋渦溶解，最好溶解時間長一點，1h左右，也可以用冰盒裝放搖床上1h〕，4℃10,000廠/山也離心30山也，收集上清。親和層析純化表達的蛋白pQE40和pET-32a(+)載體表達的蛋白C、N端均融合了6個組氨酸的tag,可用金屬螯和層析純化，也可用抗6個組氨酸的單克隆抗體檢測表達蛋白的正確性。根據(jù)表達蛋白的溶解情況分兩種方法對蛋白進行純化。天然條件下純化可溶形式的目的蛋白目的蛋白的表達和收獲：用3.2.2.1所述的方法大量表達目的蛋白。4℃下10,000rpm離心5min棄上清，向細菌沉淀中加入4℃用冰預(yù)冷的1XNi-NTA結(jié)合緩沖液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,10mmol/L咪唑，pH8.0),每100mL培養(yǎng)液加入4mL結(jié)合緩沖液，重懸菌體。一40℃冷凍，室溫溶解，反復(fù)凍融三次。再在冰水浴中超聲10min(超聲10s,間隔10s),破碎菌體。4℃下10,000rpm離心20min,保留上清液。Ni-NTAHis-Bindresin的準備：將樹脂充分重懸，取4mL懸液(每2mL樹脂懸液可吸附5-10mg蛋白)加到10mL沉降柱(gravitycolumn)中，樹脂自然沉降后，力口1XNi-NTA結(jié)合緩沖液洗兩次。目的蛋白的吸附和洗脫：將菌體上清液加到處理好的樹脂中,4℃輕柔混勻,結(jié)合2h。樹脂自然沉降后，打開沉降柱下端的管帽，讓緩沖液緩慢流出。液體流完后，加1XNi-NTA漂洗緩沖液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑，pH8.0)5mL,輕柔混勻，漂洗兩遍。結(jié)合、漂洗過程中收集上清100口L,以備電泳分析。然后加1XNi-NTA洗脫緩沖液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,,咪唑濃度分別為100、200、300、500、750和1000山口014)，按照咪唑濃度由低向高洗脫并收集目的蛋白，每0.5mL收集一管。SDS電泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。變性條件下純化包涵體形式的目的蛋白1、包涵體的純化：收集的菌體按每100mL培養(yǎng)基所得菌體加入20mLmol/LNaHPO24mol/LTris-Cl,pH8.0,不含尿素)冰浴30山皿，按前述方法進行超聲，重懸菌體。5,000義8離心15min,包涵體和細胞碎片位于沉淀中。移去上清，將沉淀重懸于20mL1X變性結(jié)合緩沖液，重復(fù)上述步驟。移去上清，按每100mL培養(yǎng)基加5mL緩沖液的比例，加入含8mol/L尿素的1X變性結(jié)合緩沖液重懸沉淀。冰浴孵育1h,徹底溶解包涵體。16,000義8離心30min去除不溶成分。Ni-NTAHis?Bindresin的準備、目的蛋白的吸附和洗脫方法同前。1X變性漂洗緩沖液(8mol尿素，0.1mol/LNaH2PO4,0.01mol/LTris-Cl,pH6.3)漂洗兩遍后，力口入pH5.9的1義變性洗脫液(8mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4,0.01mol/LTris-Cl),再用pH4.5的1X變性洗脫液mL收集一管。結(jié)合、漂洗過程中收集上清100uL,以備電泳分析。SDS電泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。變性條件下目的蛋白的切膠回收將變性條件下純化的目的蛋白的收集液進行SDS電泳，切膠回收。一20℃保存膠條。所有膠條放于研缽中,加入適量0.7%的生理鹽水,研磨成很細的顆粒狀,用1mL的針頭可以吸入。電泳檢測，估計蛋白濃度。兔和小鼠多克隆抗體的制備用作免疫的動物為日本大耳兔，體重2kg左右，由武漢病毒所動物飼養(yǎng)中心提供，按以下免疫程序來免疫。500ug純化的pQE-40-MT-2和pET32a(+)-MT-2重組融合蛋白多點注射兔腘淋巴結(jié)和腳掌，每點注射0.2mL。第一次注射2周后加強免疫2次，各次劑量為上次劑量的二分之一,每次間隔兩周。第二次、第三次蛋白溶液背部皮下、腳掌多點注射。在第三次免疫2周后，自頸動脈抽取血液。將兔血37℃放置1h后再在4℃放置過夜，1500義8離心30min,吸取上層的多抗血清，分裝后于一70℃凍存。同時還用pET32a(+)-MT-2重組融合蛋白免疫了5只4周齡的昆明雄性小鼠，每只每周一次皮下注射40ug，6周后眼球取血，小鼠抗體血清的處理方法和兔抗體血清的處理方法相同。免疫印跡檢測鱖MT-2在各組織內(nèi)的分布實驗用鱖，體重為400g左右，免疫前馴養(yǎng)一周。用于免疫印跡的器官包括鰓、肝臟、心臟、腎臟、肌肉、頭腎、腦、脾臟和腸道。將所取的組織分別在MEB緩沖液〔100mmol/L0-磷酸甘油，20mmol/LHEPES，20mmol/LEGTA，15mmol/LMgCl2，，臨用前力口入1mmol/LDTT，2mmol/LPMSF，|ig/mLleupetin，2.5|ig/mLaprotinin〕中勻漿，-40℃凍存。臨用前將組織勻漿液14,000rpm4℃離心10min取上清，用于免疫印跡檢測。將預(yù)染Marker、純化蛋白樣品和含5ug蛋白的組織提取液經(jīng)16.5%SDS膠(Bio-RadMini-Protein電泳系統(tǒng)〕別離，電泳條件：10mA1h,20mA至電泳結(jié)束。將電泳后膠板在轉(zhuǎn)膜緩沖液〔，192mmol/L甘氨酸，30%甲醇〕中平衡20min。按照伯樂半干電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Trans-BlotSDsemi-dryelectrophoretictransfercell〕操作指南裝配轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，室溫下以15V(120-180mA〕轉(zhuǎn)膜30min,將蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇浸潤過的0.22um的聚偏氟乙烯膜〔PVDF〕膜上。用TBS溶液(10mmol/LTris-ClpH,150mmol/LNaCl〕輕輕漂洗膜10min,再用2.5%的戊二醛固定1h,以防止蛋白在隨后的洗膜和孵育中脫落。然后用TBS洗膜10minX3,再用5%脫脂奶粉(溶于TBS中，含0.05%Tween20〕室溫封閉2h后，用5%脫脂奶粉(溶于TBS中，含0.05%Tween20〕按1：500稀釋一抗，一抗采用兩種重組蛋白免疫產(chǎn)生的兔抗MT-2抗體，4℃封閉過夜，再用TBST洗膜10minX3。以1：1000的稀釋比例加入堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗室溫孵育2h。用TBST溶液洗膜10minX3,每次10min,再用ddHO洗膜10min。2最后用NBT/BCIP濃縮顯色試劑盒配置的底物溶液顯色1-5min,濾膜置于ddHO溶液中2終止反應(yīng)。免疫組織化學(xué)檢測鱖MT-2的在細胞內(nèi)的分布實驗用鱖，體重為4008左右，免疫前馴養(yǎng)一周。石蠟組織包埋與切片1、取材與固定：迅速取肝臟和腎臟組織剪切成厘米的小長條放入4%的多聚甲醛固定液中直接固定24團4℃冰箱保存。2、沖洗：固定以后，須在自來水下流水沖洗10分鐘。3、脫水：材料要切成薄片必須以石蠟包埋。為使石蠟?zāi)芡溉氩牧蟽?nèi)部，必須除去其內(nèi)部的水分。這種除去材料內(nèi)部水分的操作過程，稱為脫水。脫水通常用酒精，必須漸進，不能急驟，否則會引起材料不均勻的收縮。脫水時用70%、80%、90%、95%、100%各級酒精。每級10-30分鐘。4、透明：此時材料內(nèi)部浸滿酒精，石蠟仍難滲入，必須用既能與酒精混合又能溶解石蠟的媒浸劑浸漬，本試驗采用二甲苯。每次20-30分鐘，進行2次，時間不能長，久浸會使材料變脆，造成切片困難。5、浸蠟：指石蠟浸入材料內(nèi)部的操作過程。將溶解的石蠟倒入浸蠟杯內(nèi)，將透明好的組織放入，中間換二次蠟，每次20-30分鐘，將溫箱溫度調(diào)到與石蠟熔點相同，如溫度過高，包埋物變得硬脆，堅實不易切片。6、包埋：將材料包埋在石蠟中以便于切片。將熔化的石蠟倒入包埋器中，用熱鑷子把材料迅速移入包埋器中，并擺好位置，觀察面向下擺放。之后，將包埋器放置于水面，緩慢浸入水中。等石蠟完全凝結(jié)以后，從水中取出，并注明包埋物的編號和日期等。7、切片：將材料連同周圍的石蠟用解剖刀切修成梯形，四周距離材料1-2毫米，前端離材料宜近。用少許石蠟將蠟塊固定在木塊上。將有蠟塊的木塊固定在切片機上，并調(diào)節(jié)切片刀的固定器或材料固定器，使切片刀與蠟塊靠近。調(diào)節(jié)切片厚度為4微米，進行切片，并將切片用毛筆移在鋪有黑紙的盤中。每節(jié)蠟帶不超過蓋玻片的長度。8、展片與貼片：將切好的蠟帶，放入溫度為40-50℃的水浴鍋內(nèi)，根據(jù)蠟溶與水面的張力，展平組織，取一小滴蛋白甘油涂在載玻片上，用小拇指外側(cè)把它涂成薄層，涂抹面積要超過蠟片所用的面積，涂抹得越薄越均勻越好。用解剖針把蠟片段拖于載玻片上,玻片45-50℃烘干。9、脫臘：把玻片放入盛有二甲苯的染缸中，熔去石蠟〔3分鐘〕，再經(jīng)第二缸〔3分鐘〕。10、水化：經(jīng)70%--80%--90%--95%各級酒精入水。檸檬酸緩沖液煮沸抗原修復(fù)1、石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS〔〕沖洗3次，每次3分鐘〔3義3’〕。2、將組織切片浸泡于蒸餾水中待用。3、取一定量的檸檬酸緩沖液于燒杯中，放在電爐上加熱至沸騰。4、將脫蠟水化后的組織切片至于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，煮20分鐘。5、燒杯離開火源冷卻至室溫，才能從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，然后用PBS〔〕沖洗2次，每次3分鐘。免疫織化學(xué)染色1、每張切片加50ul過氧化酶阻斷溶液〔試劑A〕，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫下孵育10分鐘。2、PBS沖洗3次，每次3分鐘。3、甩去PBS液，每張片加50ul的非免疫性動物血清〔試劑8〕，室溫下孵育10分鐘。4、甩去血清，每張切片加50ul的稀釋好的小鼠MT抗體〔抗體的稀釋比為1：500〕，用非免疫血清代替一抗作為陰性對照，放入4℃冰箱過夜。5、PBS沖洗3次，每次3分鐘。6、甩去PBS液，每張切片加50ul的生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10分鐘。7、PBS沖洗3次，每次3分鐘。8、甩去PBS液，每加50ul鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液〔試劑D〕，在室溫下孵育10分鐘。9、PBS沖洗3次，每次3分鐘。學(xué)習(xí)文檔僅供參考學(xué)習(xí)文檔僅供參考學(xué)習(xí)文檔僅供參考學(xué)習(xí)文檔僅供參考10、甩去PBS液，每張切片加100ul新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘，陽性顯色為棕色。11、自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。12、0.1%HCl分化，PBS沖洗返藍。13、DAB顯色后，切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，滴加中性樹膠后蓋上蓋玻片封固。14、實驗觀察與拍照：切片完成后，可在顯微鏡下觀察到正常肝、腎組織的染色情況并進行拍照。柱純化蛋白：一、柱平衡：5、加到用平衡緩沖液平衡好的Ni-NTAHisBindResin柱子內(nèi)（Ni-NTAHisBindResin柱子平衡按說明書），混勻，收集流穿液；用含50mmol/L咪唑的洗脫Buffer〔50mM咪唑，〕洗脫雜蛋白，最后用含250mmol/L咪唑的洗脫Buffer[250mM咪唑，〕洗脫目的蛋白。將純化的重組蛋白采取逐步降低尿素濃度的方法，透析除去蛋白溶液中的尿素，使變性的蛋白在此過程中自然復(fù)性。先用含6mol/L尿素的PBS緩沖液4℃透析過夜，然后分別用4.0、3.0、2.0、1.0、0.5mol/L的梯度透析各4h以上，最后用PBS緩沖液再透析4h以上。透析結(jié)束后，將蛋白溶液在4℃于12,000r/min離心10min，上清即為可溶的復(fù)性蛋白，聚乙二醇8000濃縮，2ml離心管分裝保存于-80℃冰箱。ProteinminiprepsunderdenaturingconditionsMaterialsMicrocentrifugetubesNi-NTAHis?BindResinBuffersA-C,E(seepage27)Transfer1mlbacterialculturetoamicrocentrifugetube.Theamountofcultureuseddependsontheproteinexpressionlevel.Onemlissufficientiftheproteinisexpressedathighrates(seeTable1,page4).Iflowerexpressionratesareexpected,largervolumesmaybenecessary.Ifatimecourseofexpressionisbeingperformed,take1mlsamplesofalargercultureat30minintervalsafterinduction,collectthecellpelletsandstorethemat-20°Cuntilallthesamplesarereadyforprocessing.Harvestthecellsbycentrifugationfor1minat15,000xganddiscardsupernatants.Iflargerculturevolumesarerequired,refillmicrocentrifugetubeandcentrifuge.Repeatthisstepuntilallcellsareharvested.Resuspendcellsin200glbufferB.Lysecellsbygentlyvortexing,takingcaretoavoidfrothing.Thesolutionshouldbecometranslucentwhenlysisiscomplete.MostproteinsaresolubleinbufferB.Ifthesolutiondoesnotbecometranslucent,lysecellswithbufferA.Centrifugethelysatefor10minat15,000xgtoremovethecellulardebris,andtransferthesupernatanttoafreshtube.Add50glofa50%slurryofNi-NTAHis?BindResin(25glresinhasacapacityfor125-250ggHis?Tagfusionprotein)toeachtube,andmix