北京大學(xué)生物顯微鏡課件

特殊生物顯微鏡的原理與使用北京大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)前第1頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第2頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第3頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第4頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)主要內(nèi)容暗視野顯微鏡相差顯微鏡偏光顯微鏡微分干涉顯微鏡熒光顯微鏡激光共焦掃描顯微鏡當(dāng)前第5頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)1暗視野顯微鏡根據(jù)丁達(dá)爾效應(yīng)原理設(shè)計(jì)的一種在黑色背景條件下觀察被檢物體的顯微鏡觀察到明場(chǎng)看不到的極其微小的物體最高分辨率可達(dá)0.004微米當(dāng)前第6頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)1.1原理丁達(dá)爾現(xiàn)象：在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微粒灰塵是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進(jìn)來(lái)，灰塵便粒粒可見了，這就是微粒發(fā)光。暗視野顯微鏡就是利用微粒發(fā)光原理設(shè)計(jì)的。1.2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使用中央遮光板或暗視野聚光器（常用的是拋物面聚光器），使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個(gè)視野是黑暗的。當(dāng)前第7頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)暗場(chǎng)顯微鏡原理當(dāng)前第8頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第9頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)1.3成像特點(diǎn)及優(yōu)缺點(diǎn)在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時(shí)，并大于1／2波長(zhǎng)，則各級(jí)衍射光線同時(shí)進(jìn)入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運(yùn)動(dòng)，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動(dòng)等。當(dāng)前第10頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)1.4應(yīng)用：微小粒子、細(xì)菌形態(tài)、細(xì)菌記數(shù)，透明標(biāo)本觀察等。1.5暗場(chǎng)顯微鏡的要求要求載玻片和蓋玻片必須無(wú)疵痕和灰塵物鏡前透鏡必須清潔無(wú)塵載玻片和蓋玻片厚度必須絕對(duì)符合要求當(dāng)前第11頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)1.6暗場(chǎng)觀察方式調(diào)節(jié)(1)換上暗場(chǎng)聚光鏡（干燥系或油浸系）并在聚光鏡透鏡上表面滴上鏡頭油。向上緩慢調(diào)升聚光鏡，使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場(chǎng)光闌適當(dāng)縮小，用10X物鏡找到被檢物體，同時(shí)在視場(chǎng)中看到視場(chǎng)光圈的輪廓象。上下緩慢調(diào)整聚光鏡，使視場(chǎng)光圈像清晰可見。(3)視場(chǎng)光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側(cè)兩個(gè)調(diào)節(jié)螺絲進(jìn)行調(diào)整，再將其開大到相應(yīng)位置。當(dāng)前第12頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)2相差顯微鏡2.1原理光波有振幅（亮度）、波長(zhǎng)（顏色）及相位(指在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置)的不同。當(dāng)光通過(guò)物體時(shí)，如波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標(biāo)本的道理。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部微細(xì)結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光波通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應(yīng)發(fā)生的差異即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無(wú)法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。當(dāng)前第13頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第14頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時(shí)它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。2.2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相位板的物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)記)代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸調(diào)節(jié)用的望遠(yuǎn)鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。當(dāng)前第15頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)相位板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡是用來(lái)進(jìn)行合鈾調(diào)節(jié)的。相差顯微鏡在使用時(shí)，聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合（共軛重合），才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。當(dāng)前第16頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)2.3使用方法（1）相差裝置的調(diào)換安裝卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍(lán)色光，使波長(zhǎng)范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再?gòu)霓D(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。

（2）調(diào)焦打開光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤，將“0”對(duì)準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器部分進(jìn)入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進(jìn)行對(duì)光和調(diào)焦。旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，如相差物鏡為40X時(shí)應(yīng)用40X標(biāo)示孔的光闌。當(dāng)前第17頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)（3）合鈾調(diào)整拔出目鏡，插入合鈾望遠(yuǎn)鏡，一邊從望遠(yuǎn)鏡向內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其上升，當(dāng)對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時(shí)可將望遠(yuǎn)鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。（4）觀察換回目鏡，按常規(guī)要領(lǐng)進(jìn)行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時(shí)，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌。當(dāng)前第18頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)2.4用途用于觀察組織培養(yǎng)中活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)?；罴?xì)胞無(wú)色透明，一般光鏡下不易分辨細(xì)胞輪廓及其結(jié)構(gòu)，組織培養(yǎng)研究常用的是倒置相差顯微鏡。當(dāng)前第19頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)偏光顯微鏡依據(jù)波動(dòng)光學(xué)原理觀察和精密測(cè)定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡分辨率可達(dá)0.04微米將普通光改變?yōu)槠窆膺M(jìn)行鏡檢,以鑒別某一物質(zhì)具有單折射性(各向同性)或雙折射性(各向異性)當(dāng)前第20頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)一、偏振光與自然光1.橫波的偏振性光矢量的振動(dòng)方向總與光的傳播方向垂直，在垂直于光傳播方向的平面內(nèi),可有不同的振動(dòng)方向。v0HE只有橫波才有偏振現(xiàn)象當(dāng)前第21頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)2.線偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振動(dòng)。E播傳方向振動(dòng)面3.自然光—普通光源發(fā)出的光,在垂直于傳播方向的平面上,所有可能方向的光矢量E的振幅都相等。當(dāng)前第22頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)二、起偏和檢偏起偏：使自然光（或非線偏振光）變成線偏振光的過(guò)程。檢偏：檢查入射光的偏振性的過(guò)程。雙折射現(xiàn)象：一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光的現(xiàn)象。尼科耳棱鏡。在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細(xì)胞的化學(xué)研究。當(dāng)前第23頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)尋常光線(o光):遵守折射定律。對(duì)于晶體一切方向都具有相同的折射率，且在入射面內(nèi)傳播。非常光線(e光):不遵守折射定律。它的折射率隨方向而變化，并且不一定在入射面內(nèi)傳播。o光和e光都是線偏振光,且振動(dòng)方向相互垂直當(dāng)前第24頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)二向色性：某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）對(duì)光振動(dòng)有強(qiáng)烈的選擇性吸收能力，這種性質(zhì)稱為二向色性。如電氣石晶體對(duì)自然光的某一振動(dòng)方向上的光振動(dòng)幾乎完全吸收，而垂直于該方向的光振動(dòng)只稍微減弱后通過(guò)。旋光現(xiàn)象：線偏振光通過(guò)某些透明介質(zhì)后，它的光振動(dòng)方向?qū)⒗@著光的傳播方向旋轉(zhuǎn)某一角度的現(xiàn)象，稱為旋光現(xiàn)象。這種介質(zhì)稱為旋光物質(zhì)。如石英、糖、酒石酸鉀鈉等。當(dāng)前第25頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第26頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)偏振光經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)的檢偏器后光強(qiáng)發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....當(dāng)前第27頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)偏振光經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)的檢偏器后光強(qiáng)發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....當(dāng)前第28頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)偏振光經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)的檢偏器后光強(qiáng)發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....當(dāng)前第29頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)偏振光經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)的檢偏器后光強(qiáng)發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....當(dāng)前第30頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)尼科爾棱鏡當(dāng)前第31頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第32頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)用途用于研究組織晶體物質(zhì)及纖維等的光學(xué)性質(zhì)當(dāng)前第33頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)微分干涉顯微鏡無(wú)色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)圖象呈浮雕狀的立體感觀察效果更加逼真當(dāng)前第34頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)1原理通過(guò)特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強(qiáng)度相等的光束，光束載極近的兩點(diǎn)（小于顯微鏡的分辨率）上通過(guò)被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺(jué)。2特點(diǎn)可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺(jué)觀察效果更直觀無(wú)須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而達(dá)到理想的效果。當(dāng)前第35頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第36頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)三、熒光顯微鏡一、原理熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。當(dāng)前第37頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)

什么是熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光當(dāng)前第38頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)熒光的種類：自發(fā)熒光（固有熒光）二次熒光當(dāng)前第39頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)熒光的性質(zhì)：吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長(zhǎng)＞激發(fā)波長(zhǎng)（損失熱能）熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率當(dāng)前第40頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)二、熒光顯微鏡的種類：透射式落射式當(dāng)前第41頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第42頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第43頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)三、熒光顯微鏡主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場(chǎng)聚光鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡當(dāng)前第44頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)熒光顯微鏡內(nèi)部構(gòu)造當(dāng)前第45頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)落射熒光顯微鏡光路圖當(dāng)前第46頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)透射熒光顯微鏡光路圖當(dāng)前第47頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察當(dāng)前第48頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長(zhǎng)的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長(zhǎng)的激發(fā)光透過(guò)照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過(guò)，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。當(dāng)前第49頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)四、使用方法．1．打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。3．放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；當(dāng)前第50頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)4．高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。當(dāng)前第51頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)五、用途1觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)2標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質(zhì)如神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光，某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。當(dāng)前第52頁(yè)\共有58頁(yè)\編于星期五\18點(diǎn)3細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA含量測(cè)定。4熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗），用