分子生物學(xué)許曉東

2.1染色體當(dāng)前第1頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.1.1染色體概述染色體(chromosome)是細(xì)胞核中載有遺傳信息的物質(zhì)，在顯微鏡下呈絲狀或棒狀，由核酸和蛋白質(zhì)組成，在細(xì)胞發(fā)生有絲分裂時(shí)期容易被堿性染料著色，因此而得名。同一物種內(nèi)每條染色體所帶DNA的量是一定的，但不同染色體或不同種中間變化很大。原核細(xì)胞染色體外裹著稀疏的蛋白質(zhì)，其中一部分與DNA的折疊有關(guān)，另一些則參與DNA復(fù)制、重組及轉(zhuǎn)錄過程。真核細(xì)胞的染色體中，DNA與蛋白質(zhì)完全融合在一起，其蛋白質(zhì)與相應(yīng)DNA的質(zhì)量比約為2:1。此外還有少量RNA。當(dāng)前第2頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第3頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)人類染色體顯微結(jié)構(gòu)圖19Mb210genes240Mb3453genes當(dāng)前第4頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第5頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)DNA的分布主要在染色體上細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞核遺傳細(xì)胞質(zhì)遺傳生物的遺傳例：紫茉莉葉色的遺傳當(dāng)前第6頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)在分子生物學(xué)中，我們用“染色體DNA”，是為了區(qū)別質(zhì)粒、線粒體和葉綠體DNA。了解染色體，是為了了解DNA的存在狀態(tài)，同時(shí)也是為了理解染色體水平的基因表達(dá)調(diào)控。染色體本身也是分子生物學(xué)家的研究材料，比如針對端粒的研究。當(dāng)前第7頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.1.2真核細(xì)胞染色體的組成染色體作為遺傳物質(zhì)的特征：分子相對穩(wěn)定；能自我復(fù)制，保持遺傳連續(xù)性；能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，控制生命過程；能產(chǎn)生可遺傳的變異。當(dāng)前第8頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第9頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)化學(xué)組成(1).DNA：約占30%，每條染色體一個(gè)雙鏈DNA分子是遺傳信息的載體，也就是所謂的遺傳物質(zhì)(2).蛋白質(zhì)組蛋白(histone)：呈堿性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；與DNA結(jié)合形成、維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，與DNA含量呈一定的比例非組蛋白：種類和含量不穩(wěn)定；作用還不完全清楚，可能與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)有關(guān)，在DNA遺傳信息的表達(dá)中有重要作用(3).少量的RNA（含量小于DNA含量的10%）當(dāng)前第10頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)1.蛋白質(zhì)包括組蛋白（Histone）和非組蛋白。富含賴氨酸和精氨酸HistonewereanalyzedbySDS當(dāng)前第11頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第12頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)組蛋白的特性1.進(jìn)化上的極端保守性特別是H3、H4，牛、豬、大鼠的H4完全相同，牛和豌豆的H4只有兩個(gè)氨基酸的差異。2.無組織特異性僅發(fā)現(xiàn)兩個(gè)例外（鳥魚兩棲紅細(xì)胞H1->H5，精細(xì)胞魚精蛋白）3.肽鏈上氨基酸分布的不對稱性N端堿性氨基酸C端疏水氨基酸4.組蛋白的修飾作用甲基化、乙?；⒘姿峄?、ADP核糖基化等

5.富含賴氨酸的組蛋白H5只存在于鳥類、兩棲類等含有細(xì)胞核的紅細(xì)胞中當(dāng)前第13頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第14頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第15頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)肽鏈上氨基酸分布的不對稱性N端堿性氨基酸C端疏水氨基酸當(dāng)前第16頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)組蛋白的修飾作用——影響組蛋白與DNA的親和性，調(diào)控基因表達(dá)。Sitesofpost-translationalmodificationsonthehistonetails.Themodificationsshownincludeacetylation(purple),methylation(red),phosphorylation(green),andubiquitination(orange).——Genes&Dev.

2001.

15:2343-2360

當(dāng)前第17頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)非組蛋白（含量約為組蛋白的60-70%）包括酶類和細(xì)胞分裂有關(guān)的蛋白（收縮蛋白、骨架蛋白、核孔復(fù)合物蛋白、肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白）高速泳動蛋白（highmobilitygroupprotein,HMG蛋白）能與DNA結(jié)合，也能與H1作用，可能與超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。DNA結(jié)合蛋白可能是一些與DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)解物質(zhì)。A24非組蛋白C端與H2A相同，功能不詳當(dāng)前第18頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.真核生物基因組DNA特點(diǎn)：含有大量的重復(fù)序列；功能DNA序列大多被非功能DNA隔開。C值(Cvalue)：一種生物單倍體基因組DNA的總量。C值反?，F(xiàn)象(C-valueparadox)：C值往往與種系進(jìn)化的復(fù)雜程度不一致。當(dāng)前第19頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第20頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)不重復(fù)序列一個(gè)或幾個(gè)拷貝，占DNA總量的40-80%，序列長約750-2000bp.單拷貝基因也可以合成大量蛋白：蠶絲心蛋白DNA—104mRNA—109protein中度重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)10-104，占DNA總量的10-40%，編碼rRNA、tRNA和某些結(jié)構(gòu)蛋白。

高度重復(fù)序列衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)，占基因組的10-60%，由6-100個(gè)堿基組成，大多位于染色體著絲粒，功能不明，可能與染色體的穩(wěn)定性有關(guān)。當(dāng)前第21頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)當(dāng)前第22頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)3.染色質(zhì)和核小體(Chromatinandnucleosomes)染色質(zhì)DNA的Tm值比自由DNA高。染色質(zhì)DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性比自由DNA低。DNA酶I(DNaseI)對染色質(zhì)DNA的消化慢于純DNA。延伸Tm值:DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度當(dāng)前第23頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)核小體(nucleosome)是一種串珠狀結(jié)構(gòu)，由核心顆粒和連結(jié)線DNA兩部分組成，可描述如下：①每個(gè)核小體單位包括約200bp的DNA、一個(gè)組蛋白核心和一個(gè)H1；②由H2A、H2B、H3、H4各兩分子形成八聚體，構(gòu)成核心顆粒；③DNA分子以左手螺旋纏繞在核心顆粒表面，每圈80bp，共1.75圈，約146bp，兩端被H1鎖合；④相鄰核心顆粒之間為一段60bp的連接線DNA。當(dāng)前第24頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)ShorterlinkerDNAfavorLongerlinkerDNAfavor當(dāng)前第25頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)用小球菌核酸酶(Micrococcusnuclease)消化染色質(zhì)DNAJBCApril27,2007vol.282no.1712537-12546當(dāng)前第26頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)核小體單體被微球菌核酸酶處理后，隨著時(shí)間延長，其降解產(chǎn)物(DNA片段)會逐漸縮短，從200bp降至146bp，至此很難再進(jìn)一步降解。這種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)為核心顆粒，它是由146bp的DNA片段和H2A、H2B、H3和H4各2分子組成。當(dāng)前第27頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)從DNA到染色體當(dāng)前第28頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)染色體結(jié)構(gòu)的矛盾及協(xié)調(diào)DNA與組蛋白及其它包裝蛋白的結(jié)合降低了其可接近的能力。這種可接近能力的降低會影響介導(dǎo)DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和重組的蛋白與DNA間的接近和相互作用。解決壓縮DNA和接近DNA的矛盾就是如何調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu).研究已表明，單個(gè)核小體的結(jié)構(gòu)變化可允許染色體該區(qū)域的DNA與其它蛋白相互作用。核小體的結(jié)構(gòu)變化可由修飾和重建核小體的酶所介導(dǎo)。因此，了解核小體的結(jié)構(gòu)及其變化調(diào)控是解釋真核細(xì)胞DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄等過程的關(guān)鍵。當(dāng)前第29頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)Certainstainingtechniquescausethechromosomestohavetheappearanceofaseriesofstriations,whicharecalledG-bands.ThebandsarelowerinG-Ccontentthantheinterbands.GenesareconcentratedintheG-C-richinterbands.ThehumanXchromosomecanbedividedintodistinctregionsbyitsbandingpattern擴(kuò)展：ChromosomesHaveBandingPatterns當(dāng)前第30頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)果蠅(Drosophila)染色體結(jié)構(gòu)圖通過染色體形態(tài)，可以研究基因缺失、重復(fù)和倒置。當(dāng)前第31頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)PhotocourtesyofJoséBonner,IndianaUniversityThepolytenechromosomesofD.melanogasterformanalternatingseriesofbandsandinterbandsIndividualbandscontainingparticulargenescanbeidentifiedbyinsituhybridizationPolyteneChromosomesFormBands當(dāng)前第32頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)基因組龐大存在大量重復(fù)序列大部分為非編碼序列（>90%）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子(見下頁解釋)真核基因是斷裂基因，有內(nèi)含子存在大量順式作用元件（啟動子、增強(qiáng)子、沉默子）存在大量的DNA多態(tài)性有端粒結(jié)構(gòu)相對同一染色體或DNA分子而言為“順式”（cis）；對不同染色體或DNA分子而言為“反式”（trans）。當(dāng)前第33頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)延伸：什么是順反子(cistron)當(dāng)前第34頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.1.3原核生物基因組1結(jié)構(gòu)簡練絕大部分編碼蛋白質(zhì)2存在轉(zhuǎn)錄單元功能相關(guān)的基因往往集中在一起，它們可被一起轉(zhuǎn)錄成多順反子mRNA3有重疊基因閱讀框改變或不改變當(dāng)前第35頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)重疊基因OverlappinggenesBMCGenomics2008,9:169當(dāng)前第36頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.2DNA的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第37頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.2.1DNA的一級結(jié)構(gòu)DNA（脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid）的組成成分：核糖和脫氧核糖嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)當(dāng)前第38頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第39頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第40頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)多聚核苷酸鏈中新生磷酸糖苷鍵的產(chǎn)生當(dāng)前第41頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)DNA的方向是5’-3’（蛋白質(zhì)是N-C）DNA通常以線性或環(huán)狀形式存在DNA通常是雙鏈的(dsDNA)，少數(shù)是單鏈的(ssDNA)DNA的一級結(jié)構(gòu)是指4種核苷酸的排列順序。GC豐富區(qū)易形成左手螺旋反向重復(fù)的片段易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)對高級結(jié)構(gòu)的影響：延伸：5‘TCTCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGAGA’3

3‘AGAGAGAGAGAGATCTCTCTCTCTCT’55‘NNNGAAGGTCCNNNNGGACGTTCNNN’3

3‘NNNCTTGCAGGNNNNCCTGCAAGNNN’5反向重復(fù)序列（invertedrepeatsequence）回文結(jié)構(gòu)（Palindrome）NNNNCGCGTAGCGCATATGCNNNNNN當(dāng)前第42頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.2.2DNA的二級結(jié)構(gòu)DNA的二級結(jié)構(gòu)是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第43頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)堿基間形成的氫鍵當(dāng)前第44頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)B-DNA的反向平行雙螺旋結(jié)構(gòu)克里克的草圖當(dāng)前第45頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)大溝通常是蛋白質(zhì)與DNA相互作用的部位……當(dāng)前第46頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)Transcriptionactivator-likeeffectornucleases(TALENs)areartificialrestrictionenzymesgeneratedbyfusingaTALeffectorDNAbindingdomaintoaDNAcleavagedomain.當(dāng)前第47頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)DNA纏繞在組蛋白上……當(dāng)前第48頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)B構(gòu)象：生物體內(nèi)天然存在的DNA幾乎都以B-DNA存在。A構(gòu)象：是在以鈉、鉀或銫作為反向離子時(shí)，將DNA纖維在75%相對濕度下進(jìn)行X光衍射測定出來的。DNA-RNA雜交分子、RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)均為A構(gòu)象。Z構(gòu)象：在DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或其他一些生理過程中會產(chǎn)生Z-DNA結(jié)構(gòu)，之后DNA會放出能量，形成B-DNA。GC含量高的區(qū)域易于形成Z構(gòu)象。當(dāng)前第49頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)右手螺旋：A-DNA,B-DNA左手螺旋：Z-DNA當(dāng)前第50頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)Z－DNA的生物學(xué)意義：應(yīng)當(dāng)指出Z－DNA的形成通常在熱力學(xué)上是不利的。因?yàn)閆-DNA中帶負(fù)電荷的磷酸根距離太近了，這會產(chǎn)生靜電排斥。但是，DNA鏈的局部不穩(wěn)定區(qū)的存在就成為潛在的解鏈位點(diǎn)。

此外，DNA螺旋上溝的特征在其信息表達(dá)過程中起關(guān)鍵作用。Z-DNA中大溝消失，小溝狹而深，使調(diào)控蛋白識別方式也發(fā)生變化。

這些都暗示Z-DNA的存在不僅僅是由于DNA中出現(xiàn)嘌呤-啶嘧交替排列之結(jié)果，也一定是在漫漫的進(jìn)化長河中對DNA序列與結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整與篩選的結(jié)果，有其內(nèi)在而深刻的含意，只是人們還未充分認(rèn)識而已。當(dāng)前第51頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第52頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)擴(kuò)展：其他結(jié)構(gòu)Hollidayjunction由重復(fù)排列的端粒構(gòu)成的脫氧核糖核酸四聯(lián)體結(jié)構(gòu)形態(tài)當(dāng)前第53頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)DNA雙鏈的變性與復(fù)性加熱、提高pH、降低離子強(qiáng)度，都能使DNA雙鏈變性。反之，變性的DNA又可以復(fù)性。G+C含量、離子強(qiáng)度和DNA的均一性都會影響變性曲線。當(dāng)前第54頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.2.3DNA的高級結(jié)構(gòu)DNA的高級結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。1965年Vinograd等用電鏡發(fā)現(xiàn)SV40和多瘤病毒的環(huán)形DNA的超螺旋。負(fù)超螺旋松弛DNA正超螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶supercoiledlinear

opencircularTopoisomerase當(dāng)前第55頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)L=T+WL(linkingnumber)：環(huán)形DNA分子兩條鏈間交叉的次數(shù)T(twistingnumber)：盤繞數(shù)W(writhingnumber)：超螺旋數(shù)當(dāng)前第56頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)對于真核生物來說，雖然其染色體多為線形分子但其DNA均與蛋白質(zhì)相結(jié)合，兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)之間的DNA形成一個(gè)突環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)，類似于共價(jià)封閉環(huán)(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，同樣具有超螺旋形式。真核生物中，DNA與組蛋白八聚體形成核小體結(jié)構(gòu)時(shí)，存在著負(fù)超螺旋。研究發(fā)現(xiàn)，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶產(chǎn)生的。當(dāng)前第57頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.3DNA的復(fù)制過程復(fù)雜；需要多種酶和蛋白質(zhì)參與（包括拓?fù)洚悩?gòu)酶、解旋酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及連接酶等）。起始-延伸-終止當(dāng)前第58頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.3.1DNA的半保留復(fù)制最初推測的復(fù)制模型當(dāng)前第59頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.3.2DNA復(fù)制的一些基本概念復(fù)制起點(diǎn)（復(fù)制原點(diǎn),Theoriginofreplication）是固定的，能識別參與復(fù)制起始的特殊蛋白質(zhì)。DNA從復(fù)制起點(diǎn)開始復(fù)制直到終點(diǎn)為止，每一個(gè)這樣的DNA復(fù)制單位稱為復(fù)制子（replicon）。當(dāng)前第60頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)從復(fù)制起點(diǎn)開始，雙鏈解開形成叉子狀的生長點(diǎn)，叫復(fù)制叉（replicationfork）。復(fù)制叉移動的方向和速度是多種多樣的，但以雙向等速移動為主。真核生物： 雙向等速原核生物： 雙向等速（大腸桿菌） 雙向不等速（枯草桿菌） 先單向后雙向（R6K質(zhì)粒） 單向（ColE1質(zhì)粒） 相向（某些線性DNA病毒：腺病毒）當(dāng)前第61頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第62頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.3.3復(fù)制的幾種主要方式當(dāng)前第63頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)DNA的生物合成只能從5’到3’起始的時(shí)候需要一個(gè)自由的羥基當(dāng)前第64頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)1線性DNA雙鏈的復(fù)制所有已知的核酸聚合酶，無論是DNA聚合酶還是RNA聚合聚合酶都只從5’向3’端移動，新鏈的合成方向與聚合酶移動方向一致，即只能是5’→3’；而對于DNA的合成必需一段引物的存在，體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必須切除，切除后，5’端如何起始呢？end-replicationproblem當(dāng)前第65頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)通過將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。如λ噬菌體（成環(huán)）、T7噬菌體（多聚分子）。DNA可形成特殊的結(jié)構(gòu)。如草履蟲的線性線粒體DNA在末端形成發(fā)夾，使分子沒有游離末端。某種蛋白質(zhì)可能會介入，在真正的末端上啟動。幾種線性病毒核酸具有與5`端堿基共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA。末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，DNA末端的短重復(fù)序列的拷貝數(shù)改變（如端粒的復(fù)制）。當(dāng)前第66頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)??二聚體ATCGTAGCATCGTAGC專一性核酸內(nèi)切酶T7噬菌體的末端復(fù)制當(dāng)前第67頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)草履蟲線粒體DNA的末端復(fù)制CurrGenet(1993)24:241-247當(dāng)前第68頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)腺病毒通過蛋白引發(fā)的DNA復(fù)制當(dāng)前第69頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)端粒的復(fù)制NatureReviewsCancer1,203-213(December2001)當(dāng)前第70頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)延伸端粒

2009

NobelPrizeforPhysiologyorMedicine:ElizabethBlackburn，

CarolW.Greider

and

JackW.Szostak.SzostakJW,BlackburnEH.Cloningyeasttelomeresonlinearplasmidvectors.Cell1982;29:245-255.GreiderCW,BlackburnEH.IdentificationofaspecifictelomereterminaltransferaseactivityinTetrahymenaextracts.Cell1985;43:405-13.GreiderCW,BlackburnEH.AtelomericsequenceintheRNAofTetrahymenatelomeraserequiredfortelomererepeatsynthesis.Nature1989;337:331-7.四膜蟲Tetrahymena端粒長度與衰老端粒合成模型當(dāng)前第71頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制θ型（如大腸桿菌E.coli）當(dāng)前第72頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)滾環(huán)型（rollingcircle）如ФX174當(dāng)前第73頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)D-環(huán)形（D-loop）如哺乳動物線粒體DNA當(dāng)前第74頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.4原核生物和真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)當(dāng)前第75頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.4.1原核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)1DNA復(fù)制的引發(fā)oriC(84min)（dnaA結(jié)合位點(diǎn)）復(fù)制原點(diǎn),Theoriginofreplication當(dāng)前第76頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)不同原核生物的復(fù)制起始位點(diǎn)當(dāng)前第77頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)Abacterialartificialchromosome(BAC)isaDNAconstruct,basedonafunctionalfertilityplasmid(orF-plasmid),usedfortransformingandcloninginbacteria,usuallyE.coli.F-plasmidsplayacrucialrolebecausetheycontainpartitiongenesthatpromotetheevendistributionofplasmidsafterbacterialcelldivision.Thebacterialartificialchromosome'susualinsertsizeis150-350kbp.擴(kuò)展：BAC當(dāng)前第78頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)Theeight-plasmidpolI–polIIsystemforthegenerationofinfluenzaAvirus.當(dāng)前第79頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)dnaA與OriC的結(jié)合啟動了DNA的復(fù)制NatureReviewsMicrobiology

11,303–315

(2013)當(dāng)前第80頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)HU+ATP當(dāng)前第81頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)RNA引物：所有的DNA聚合酶都從3’羥基端開始DNA合成。DNA復(fù)制首先需要由引發(fā)酶在DNA模板上合成一段RNA鏈，提供引發(fā)末端。長度11±1。引發(fā)體primosome引發(fā)前體preprimosome引發(fā)酶Primase(DnaG)DnaBhelicaseDnaChelicaseassistantDnaTPriAPriBPriC當(dāng)前第82頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2DNA雙螺旋的解旋DNA解鏈酶(DNAhelicase)需要水解ATP獲得能量。大部分沿模板的5’-3’方向移動，少數(shù)沿3’-5’方向移動(Rep蛋白)。在Ecoli中，解旋酶DnaB作為引發(fā)體的成員，參與復(fù)制叉形成，并結(jié)合于一個(gè)復(fù)制叉，利用ATP水解的能量解開雙螺旋，推動復(fù)制叉向前延伸。當(dāng)前第83頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB蛋白)原核生物SSB蛋白有協(xié)同效應(yīng)。防止單鏈DNA退火。使DNA單鏈保持一種伸展構(gòu)象，它們與磷酸骨架結(jié)合，離開暴露的堿基——那些堿基能作為DNA合成的模板；使解開的單鏈不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；保護(hù)DNA單鏈不受Dnase水解。當(dāng)前第84頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)第一型拓樸異構(gòu)酶（TypeItopoisomerase）：切斷一股DNA，屬于這類型的有拓樸異構(gòu)酶I與拓樸異構(gòu)酶III等。第二型拓樸異構(gòu)酶（TypeIItopoisomerase）：切斷雙股DNA，屬于這類型的有拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα與拓?fù)洚悩?gòu)酶IIβ等。當(dāng)前第85頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)擴(kuò)展：TOPOCloning當(dāng)前第86頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)3

復(fù)制的延伸岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制岡崎片段(Okazakifragment)一般長約1000-2000個(gè)堿基，原核比真核長。前導(dǎo)鏈Leadingstrand后隨鏈Laggingstrand然后，RNaseH（大腸桿菌中為DNA聚合酶I）降解RNA引物，DNA聚合酶I補(bǔ)齊缺口，再由DNA連接酶連接兩個(gè)岡崎片段。當(dāng)前第87頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第88頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)4復(fù)制的終止Tus與約22bp的終止序列Ter結(jié)合，使dnaB不再解鏈。當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNAPNAS

September2,2008

vol.105

no.3512831-12836當(dāng)前第89頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第90頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)5DNA聚合酶所有DNA聚合酶（無論是原核生物還是真核生物來源）共同性質(zhì)：(a)在DNA聚合酶的活性中心，在模板DNA鏈的指導(dǎo)下，按照堿基互補(bǔ)配對原則對新加入的堿基具有嚴(yán)格地選擇；(b)新和成鏈的延伸方向是由5’→3’進(jìn)行，新生鏈與模板鏈反向平行。(c)DNA聚合酶不能從頭開始合成—所有的DNA聚合酶都需要一段寡聚核苷酸引物，（有3’-OH），在引物的3’-端逐個(gè)加入新的核苷酸。當(dāng)前第91頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)細(xì)菌中，已有五種DNA聚合酶被發(fā)現(xiàn)。*DNA聚合酶I（PolI）：C端(Klenow片段)具有聚合酶活性和3‘-5’外切酶活性；N端具有5‘-3’外切酶活性；能去除岡崎片段5‘端得RNA引物；有內(nèi)切酶活性。*DNA聚合酶II（PolII）：活性低，在DNA損傷修復(fù)中起作用。*DNA聚合酶III（PolIII）：活性強(qiáng)，具有聚合酶活性和3‘-5’外切酶活性，在大腸桿菌DNA復(fù)制過程中起主要作用。*DNA聚合酶IV（PolIV）：SOS修復(fù)中發(fā)揮作用。*DNA聚合酶V（PolV）：SOS修復(fù)中發(fā)揮作用。當(dāng)前第92頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)Onlywhenacorrectbasepairisformedarethe3'OHoftheprimer

andtheα-phosphateoftheincomingnucleosidetriphosphateintheoptimumpositionforcatalysistooccur.當(dāng)前第93頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)InDNApolymerase,thenucleotidebindingpocketistoosmalltoallowthepresenceofa2’OHontheincomingnucleotide.Thisspaceisoccupiedbytwoaminoacids(discriminatoraminoacids)thatmakevanderWaalscontactswiththesugarring.當(dāng)前第94頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)DNAPolymeraseHoloenzymeConsistsofSubcomplexesAclamploaderplacestheprocessivitysubunitsonDNA,wheretheyformacircularclamparoundthenucleicacid.Onecatalyticcoreisassociatedwitheachtemplatestrand.DNApolymeraseIIIholoenzymeassemblesinstages,generatinganenzymecomplexthatsynthesizestheDNAofbothnewstrands當(dāng)前第95頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)clamp當(dāng)前第96頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)TheClampControlsAssociationofCoreEnzymewithDNAThecoreontheleadingstrandisprocessivebecauseitsclampkeepsitontheDNA.Theclampassociated withthecoreonthe laggingstrand dissociatesattheendof eachOkazakifragment andreassemblesforthe nextfragment.Thedimericpolymerasemodel當(dāng)前第97頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第98頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)擴(kuò)展：雙鏈DNA上的單鏈切口可以激活DNA聚合酶Ｉ的５‘→３’的外切酶活力，從切口的５‘切去核苷酸，同時(shí)從切口開始合成新鏈，可使DNA鏈上切口向前推進(jìn)，產(chǎn)生切口平移。切口平移時(shí)，如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑杖姿釣棣粒常玻穑洌危裕校瑒t重新合成的新鏈為帶有同位素標(biāo)記的ＤＮＡ分子，可以用做探針進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)。當(dāng)前第99頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.4.2真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)真核生物是多點(diǎn)復(fù)制，原核生物是單點(diǎn)復(fù)制。真核生物在完成全部復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA復(fù)制不能再開始；原核生物起始點(diǎn)上可連續(xù)開始新的DNA復(fù)制。真核生物復(fù)制原核生物復(fù)制當(dāng)前第100頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)復(fù)制起始位點(diǎn)：自主復(fù)制序列(autonomousreplicatingsequence,ARS)這個(gè)序列是染色體正常起始復(fù)制所必需的。所有的ARS的DNA均有一段保守序列。當(dāng)前第101頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)ARS能結(jié)合起始點(diǎn)識別復(fù)合物(originrecognitioncomplex,ORC)。a|Theoriginrecognitioncomplex(ORC)isfirstrecruitedtothereplicationorigin.b|ORCrecruitsCdc6andCdt1.c|ORC,Cdc6andCdt1acttogethertoloadmultipleminichromosomemaintenance(Mcm)2–7proteinhexamersontotheorigin,whichlicensestheDNAforreplication.d|Initiation-competentcomplexesareprobablyformedbytheback-to-backassemblyoftwoMcm2–7complexes.AstheORCisasymmetrical,thismightrequiredepositionofasecondORCmoleculetoloadMcm2–7intheoppositeorientation.NatureReviewsMolecularCellBiology6,476-486(June2005)當(dāng)前第102頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)真核細(xì)胞染色體ＤＮＡ的各個(gè)區(qū)域不是全部同時(shí)復(fù)制的，Ｓ期中不斷有復(fù)制子被活化，直至整個(gè)染色體完全復(fù)制。在真核生物基因組復(fù)制過程中，只有部分復(fù)制位點(diǎn)起作用，這可能與染色體結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、生物發(fā)育過程、ＤＮＡ的甲基化等因素有關(guān)。例如，動物發(fā)育過程中，細(xì)胞周期的Ｓ期在胚胎期可以只有幾分鐘，在成熟組織中長達(dá)幾小時(shí)。ＤＮＡ復(fù)制在Ｓ期的及時(shí)完成主要取決于有效復(fù)制起始位點(diǎn)的增加，而不是復(fù)制叉移動速度的增加。當(dāng)前第103頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)已發(fā)現(xiàn)15種真核DNA聚合酶，在哺乳動物細(xì)胞中有5種：Polα：做為引發(fā)酶合成RNA引物，然后做為DNA合成酶延伸此段RNA引物；合成數(shù)百個(gè)堿基后，將后續(xù)的延伸過程交給Polδ與ε。Polβ：在DNA修復(fù)中起作用。Polγ：復(fù)制線粒體DNA。Polδ：Polδ與Polε是真核細(xì)胞的主要DNA聚合酶。（前導(dǎo)鏈）Polε：填補(bǔ)引物空隙，切除修復(fù)，重組。（岡崎片段）

（真核生物DNA聚合酶一般不具有外切酶活性，推測有其他的酶參與校對。）去除岡崎片段：分兩步，RNA酶H1切斷DNA-RNA，F(xiàn)EN1蛋白降解RNA片段，DNA連接酶連接兩個(gè)岡崎片段。當(dāng)前第104頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.4.3DNA復(fù)制的調(diào)控大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制調(diào)控 復(fù)制起始不依賴于細(xì)胞分裂，復(fù)制終止則能引發(fā)細(xì)胞分裂。復(fù)制調(diào)控主要發(fā)生在起始階段。

對dam-E.Coli的研究表明，半甲基化的OriC不能發(fā)動一輪新的復(fù)制 在復(fù)制過程中，OriC的半甲基化狀態(tài)約保留13min。而在基因組其它區(qū)域的GATC位點(diǎn)，在復(fù)制后1.5min內(nèi)即被甲基化。當(dāng)前第105頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第106頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)ColE1質(zhì)粒DNA的復(fù)制調(diào)控引物RNA前體的轉(zhuǎn)錄起始于復(fù)制起點(diǎn)上游555個(gè)核苷酸處，需經(jīng)RNaseH加工后產(chǎn)生有555個(gè)核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3’末端起始DNA合成。RNA1的編碼區(qū)在引物RNA編碼區(qū)的5’末端，轉(zhuǎn)錄方向與引物RNA相反，因此與引物RNA的5’末端互補(bǔ)。RNA1通過氫鍵配對與引物RNA前體相互作用，阻止了RNaseH加工引物前體，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物而對復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。（負(fù)調(diào)控）當(dāng)前第107頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)不存在RNA1時(shí)，RNA引物前體形成自身的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，起類似終止子的作用當(dāng)前體RNA與RNA1互補(bǔ)配對時(shí)，類終止子效應(yīng)消失，引物前體的轉(zhuǎn)錄被繼續(xù)，阻止了RNaseH加工引物前體Rop蛋白能提高RNA1與引物前體的相互作用，從而加強(qiáng)了RNA1的負(fù)調(diào)控作用當(dāng)前第108頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)3.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控（1）細(xì)胞生活周期水平調(diào)控DNA復(fù)制只發(fā)生在S期

S期的主要事件是DNA復(fù)制，該過程將準(zhǔn)確生成兩套半保留的染色體。對此，有人提出“DNA復(fù)制執(zhí)照”假說，該假說認(rèn)為細(xì)胞中存在一種因子使DNA僅能復(fù)制一次。且該因子將不斷降解從而使DNA復(fù)制于G2期中止，并直至下一次M期重新接觸到該因子才可繼續(xù)復(fù)制。有實(shí)驗(yàn)證明Mcm、Orc蛋白等成分構(gòu)成了執(zhí)照因子。（2）染色體水平調(diào)控不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定的時(shí)間順序在S期起始復(fù)制。機(jī)理還不清楚。（3）復(fù)制子水平調(diào)控

各個(gè)復(fù)制子按專一的時(shí)間順序活化。

當(dāng)前第109頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)Thecelldivisioncycleanditscontrol.Thecellcycleisdividedintofourdistinctphases(G1,S,G2,andM).TheprogressionofacellthroughthecellcycleispromotedbyCDKs,whicharepositivelyandnegativelyregulatedbycyclinsandCKis,respectively.Asshown,cyclinDisoformsinteractwithCDK4andCDK6todrivetheprogressionofacellthroughG1.CyclinD/CDK4,6complexesphosphorylatepRb,whichreleasesE2Ftotranscribegenesnecessaryforcellcycleprogression.TheassociationofcyclinEwithCDK2isactiveattheG1-StransitionanddirectsentryintoS-phase.TheINK4sbindandinhibitcyclinD-associatedkinases(CDK4andCDK6).ThekinaseinhibitorproteingroupofCKi,p21Cip1/Waf-1,p27Kip1,andp57Kip2,negativelyregulatecyclinD/CDK4,6andcyclinE/CDK2complexes.S-phaseprogressionisdirectedbythecyclinA/CDK2complex,andthecomplexofcyclinAwithCdk1isimportantinG2.CDK1/cyclinBisnecessaryfortheentryintomitosis.CurcuminmodulatesCKis,CDK-cyclinandRb-E2FcomplexestorenderG1-arrestandaltersCDK/cyclinBcomplexformationtoblockG2/Mtransition.SaandDasCellDivision20083:14doi:10.1186/1747-1028-3-14當(dāng)前第110頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第111頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.5DNA的修復(fù)維持DNA序列的保真性；可在復(fù)制前后進(jìn)行；有多種修復(fù)機(jī)制來糾正DNA損傷；DNA修復(fù)失敗可能導(dǎo)致突變和腫瘤。當(dāng)前第112頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)怎么損傷的？1自發(fā)損傷DNA復(fù)制中的錯誤（10-1~-2->10-5~-6->10-10）DNA自發(fā)性化學(xué)變化（堿基異構(gòu)、脫氨基、脫嘌呤嘧啶、堿基修飾）2物理因素紫外線電離輻射3化學(xué)因素烷化劑堿基類似物（5-溴尿嘧啶……）EB當(dāng)前第113頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)mismatchrepair(MMR)–Atypeofrepairthatcorrectsmispairedbases,typicallyimmediatelyfollowingreplication.Theprocesspreferentiallycorrectsthesequenceofthedaughterstrandbydistinguishingthedaughterstrandandparentalstrand,sometimesonthebasisoftheirstatesofmethylation.Thehumangenomehasmanyrepairgenes修復(fù)方式概覽當(dāng)前第114頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.5.1錯配修復(fù)當(dāng)前第115頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第116頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.5.2切除修復(fù)AP位點(diǎn)所有細(xì)胞中都帶有不同類型、能識別受損核酸位點(diǎn)的糖苷水解酶，它能夠特異性切除受損核苷酸上的N-β-糖苷鍵，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點(diǎn)，統(tǒng)稱為AP位點(diǎn)(apurinic/apyrimidinicsite)。AP位點(diǎn)AP核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶IDNA連接酶1.堿基切除修復(fù)當(dāng)前第117頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第118頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.核苷酸切除修復(fù)當(dāng)前第119頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.5.3重組修復(fù)有時(shí)在進(jìn)行DNA修復(fù)之前，受損環(huán)的DNA鏈常常還能進(jìn)行復(fù)制。在這種情況下，受損親代鏈的復(fù)制受損壞堿基的干擾，跨過這段損壞序列后，此時(shí)在新的一個(gè)起點(diǎn)繼續(xù)開始復(fù)制，此時(shí)新合成的子代鏈的堿基序列就有了一個(gè)缺口。這種缺口可以通過重組修復(fù)機(jī)制糾正。這種修復(fù)機(jī)制有點(diǎn)類似于遺傳重組。

當(dāng)進(jìn)行第二輪復(fù)制時(shí)，如果損傷還留在母鏈上，仍會給復(fù)制帶來困難，復(fù)制經(jīng)過損傷部位時(shí)所產(chǎn)生的缺口還需通過同樣的重組過程來彌補(bǔ)，直至損傷被切除修復(fù)所消除。但是，隨著復(fù)制的不斷進(jìn)行，若干代后，即使損傷始終未從親代鏈中除去，而在后代細(xì)胞群中也已被稀釋，實(shí)際上消除了損傷的影響。當(dāng)前第120頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.5.4DNA的直接修復(fù)當(dāng)前第121頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第122頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第123頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.5.5SOS反應(yīng)SOS修復(fù)（SOSresponse）是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時(shí)所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(fù)（error-pronerepair），使細(xì)胞有較高的突變率。在SOS修復(fù)中，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生校對功能低的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，合成的新的DNA鏈?zhǔn)遣恢覍?shí)的，有許多不配對的堿基，而復(fù)制仍可進(jìn)行。往往導(dǎo)致突變的產(chǎn)生，但對細(xì)胞來說，比根本不能存活要好。在此情況下允許錯配可增加存活的機(jī)會。

當(dāng)前第124頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)DamagetoDNAcausesRecAtotriggertheSOSresponse,whichconsistsofgenescodingformanyrepairenzymes.RecAactivatestheautocleavageactivityofLexA.LexArepressestheSOSsystem;itsautocleavageactivatesthosegenes.LexAandRecAhaveareciprocallyantagonisticrelationshipRecATriggerstheSOSSystem當(dāng)前第125頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)SOSresponseinE.coli

當(dāng)前第126頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.6DNA的轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的定義:能將自身插入基因組新位置的DNA序列。當(dāng)前第127頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第128頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.6.1轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征每個(gè)IS轉(zhuǎn)座頻率是10-4~10-6/世代，恢復(fù)頻率則低得多，約為10-10~10-6/世代。插入序列（insertionalsequence,IS）

當(dāng)前第129頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)（1）含短的末端反向重復(fù)序列;（2）含編碼轉(zhuǎn)座酶的基因;（3）靶位點(diǎn)存在5-9bp的短正向重復(fù)序列。插入序列的結(jié)構(gòu)特征當(dāng)前第130頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）

當(dāng)前第131頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)當(dāng)前第132頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)TheorderofeventsandexactnatureoftheconnectionsbetweentransposonandtargetDNAdeterminewhethertranspositionisreplicativeornonreplicative.TransposoniscopiedtonewsiteTransposonmovestonewsite當(dāng)前第133頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.6.2真核生物中的轉(zhuǎn)座子當(dāng)前第134頁\共有149頁\編于星期五\3點(diǎn)2.6.2真核生物中的轉(zhuǎn)座子自主性轉(zhuǎn)座子（autonomoustransposon）：具有自主剪接和轉(zhuǎn)座功能。非自主性轉(zhuǎn)座子（nonautonomous