塔格糖生物轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展演示文稿

塔格糖生物轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展演示文稿當(dāng)前第1頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)塔格糖生物轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展當(dāng)前第2頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)Contents1.塔格糖的生理活性和功能2.塔格糖的應(yīng)用現(xiàn)狀3.塔格糖的專利情況4.生物法生產(chǎn)塔格糖的進(jìn)展

5.個(gè)人總結(jié)當(dāng)前第3頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)塔格糖的生理活性和功能當(dāng)前第4頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)塔格糖的理化性質(zhì)屬性值化學(xué)家族碳水化合物，單糖，己酮糖，D-半乳糖的異構(gòu)體分子式C6H12O6分子量180物理性狀白色晶體氣味無熔點(diǎn)134℃pH范圍2.0-7.0溶解性

58%w/w（21℃）相對(duì)甜度為蔗糖的92%（10%溶液中）冷卻效應(yīng)無卡路里值1.5kcal/g美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)是當(dāng)前第5頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)塔格糖的生理活性和功能1.提供低能量2.降低血糖3.具有腸道生物活性4.抗齲齒

當(dāng)前第6頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)美國Spherix公司生產(chǎn)的塔格糖名稱當(dāng)前第7頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)當(dāng)前第8頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)塔格糖代謝途徑高等動(dòng)物由于不具塔格糖-6-磷酸途徑，因此D-塔格糖不能被自然地代謝。當(dāng)前第9頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)塔格糖的應(yīng)用現(xiàn)狀2000年FDA已正式批準(zhǔn)塔格糖作為甜味劑用于食品飲料業(yè)以及醫(yī)藥制劑中；JECFA（聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑委員會(huì)）第57次會(huì)議批準(zhǔn)塔格糖作為食品添加劑，推薦ADI值0-80mg/kg；歐盟也于2003年批準(zhǔn)塔格糖在歐洲上市；目前塔格糖在美國已被大量用于健康飲料以及酸奶、果汁等產(chǎn)品中作為白糖的代用品。塔格糖產(chǎn)品目前已獲得美國、澳大利亞、日本、韓國等食品衛(wèi)生部門批準(zhǔn)使用，在我國仍未獲得批準(zhǔn)使用。當(dāng)前第10頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)塔格糖的應(yīng)用現(xiàn)狀2006年8月百事可樂公司正式在雪碧飲料中使用塔格糖，作為風(fēng)味的強(qiáng)化劑，這是塔格糖第一次進(jìn)入商業(yè)領(lǐng)域。

2007年新西蘭Miada運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品公司將塔格糖應(yīng)用于巧克力產(chǎn)品的開發(fā)，五月投放澳大利亞和新西蘭超級(jí)市場。據(jù)BCC預(yù)測，新進(jìn)入市場的塔格糖將會(huì)以一種穩(wěn)定的速度增長，估計(jì)在今后五年內(nèi)為20％～25％。

當(dāng)前第11頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)關(guān)于塔格糖的專利情況

2000

ProcessformanufacturingD-tagatose

從干酪乳清、牛奶或其混合物中利用若干步驟（包括L-AI催化）產(chǎn)生D-塔格糖，涉及了許多常溫菌屬。2005ThermostableL-AIandprocessforpreparingD-tagatose

（韓國）

利用源自耐熱菌屬Thermotoganeapolitana的熱穩(wěn)定L-AI生產(chǎn)塔格糖，及其基因表達(dá)當(dāng)前第12頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)關(guān)于塔格糖的專利情況2006Processformanufacturingoftagatose

（丹麥）

Bacillus,Sulfolobus,ThermoanaerobacterorThermotoga2006Thermostableisomeraseandusehereof,inparticularforproducingtagatose

（丹麥）

ThermoanaerobacterspeciessuchasThermoanaerobactermathranii當(dāng)前第13頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)生物法生產(chǎn)塔格糖的最新進(jìn)展生物法化學(xué)法化學(xué)污染物堿性條件副產(chǎn)物多分離困難當(dāng)前第14頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)當(dāng)前第15頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)Jung-WooKim等利用大腸桿菌克隆表達(dá)了耐熱均Thermussp.IM6501的AI，該酶最適pH和溫度分別為8.0和60℃，并且60U該酶在10mL0.1%半乳糖溶液中反應(yīng)3天最終轉(zhuǎn)化率達(dá)54%。當(dāng)前第16頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)研究了耐熱酶BHAI和GSAI對(duì)金屬的依賴性及對(duì)金屬與酶的構(gòu)相及活性之間的關(guān)聯(lián)。BHAI無金屬依賴性，GSAI的活性受Mn2+的影響。推測金屬在較高的溫度下調(diào)節(jié)著該酶的活性三級(jí)結(jié)構(gòu)。BHAIGSAI當(dāng)前第17頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)首次研究了嗜酸耐熱菌的AI,最適pH為6.0-6.5，并與源自耐熱菌B.halodurance的AI（最適pH為7.5-8.0）進(jìn)行比較研究，得到兩種突變酶K269E和E268K，Lys-296對(duì)pH有重要作用。

當(dāng)前第18頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)在大腸桿菌中表達(dá)了源自耐熱菌Thermoanaerobactermathranii的AI，并研究了雙酶及三酶偶聯(lián)連續(xù)化反應(yīng)器生產(chǎn)塔格糖及混合糖漿。25h后，塔格糖含量可達(dá)200mM當(dāng)前第19頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)

G.thermodenitrificansL-AI經(jīng)過單點(diǎn)和雙點(diǎn)定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得2個(gè)突變點(diǎn)的酶（分別是N475K單點(diǎn)突變和C450S-N475K雙點(diǎn)突變），經(jīng)檢測，這兩種突變酶的酶活為原始酶的1.7和2.6倍。而且使塔格糖的轉(zhuǎn)化率也分別提高12%和20%。當(dāng)前第20頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)MoezRhimi等在大腸桿菌中表達(dá)了B.stearothermophilusUS100的AI,該酶無金屬依賴性并且熱穩(wěn)定性高，最適pH和溫度分別為7.5和80℃,3mg酶在含有5mM半乳糖的體系中在70℃時(shí)7h轉(zhuǎn)化率達(dá)48%。(51U/mg)65℃75℃70℃當(dāng)前第21頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)大腸桿菌L-AI單體含有498個(gè)氨基酸殘基，其晶體結(jié)構(gòu)如左圖，由16個(gè)β折疊和17個(gè)α螺旋構(gòu)成，可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：N-端結(jié)構(gòu)域（1-176Aa）、中間結(jié)構(gòu)域（177-327Aa）和C-端結(jié)構(gòu)域（328-498Aa）。

大腸桿菌L-AI晶體結(jié)構(gòu)帶狀圖當(dāng)前第22頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)大腸桿菌L-AI發(fā)揮酶的活性需要在三聚體下才能發(fā)揮，分別記號(hào)為A、B、C。三聚體的外表面顯示出三個(gè)等價(jià)的裂口，裂口的組成為一個(gè)亞基的C-端結(jié)構(gòu)域和中間結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)亞基的N-端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成沿著裂口的氨基酸殘基在嗜溫、嗜熱和高度嗜熱的L-AI中都非常保守，這些殘基大多位于一個(gè)環(huán)區(qū)域，表明其可能為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)以調(diào)節(jié)活性位點(diǎn)中底物進(jìn)入和產(chǎn)物釋放時(shí)的立體結(jié)構(gòu)。

當(dāng)前第23頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)大腸桿菌L-AI的裂口氨基酸組成與空間結(jié)構(gòu)推測的酶結(jié)合與催化中心當(dāng)前第24頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)A.Glu306的Oε2親核進(jìn)攻D-半乳糖C-2的氫原子使其去質(zhì)子化，形成碳碳雙鍵，碳氧雙鍵斷裂，形成氧負(fù)離子，氧負(fù)離子結(jié)合質(zhì)子，最終形成ene-diol（烯二醇）中間體；B.Glu333的Oε2親核進(jìn)攻D-半乳糖C-2的羥基氫，生成C-2位置的碳氧雙鍵，C-1與C-2之間的碳碳雙鍵斷裂，生成碳負(fù)離子，結(jié)合質(zhì)子，最終生成D-塔格糖。推測的酶反應(yīng)機(jī)理—烯二醇中間體反應(yīng)機(jī)理ABCH當(dāng)前第25頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)固定化表達(dá)源自耐熱菌ThermotoganeapolitanaAI的大腸桿菌細(xì)胞以進(jìn)一步提高熱穩(wěn)定性生產(chǎn)塔格糖。最適溫度由85提高到90℃，70℃時(shí)的半衰期由0.8h提高到1.3h。2.5U酶量，在12mL0.5M半乳糖體系中20h轉(zhuǎn)化率超過50%。當(dāng)前第26頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)MoezRhimi等首次在大腸桿菌中共表達(dá)分別源自BacillusstearothermophilusUS100和StreptomycesSK的L-arabinoseisomerase和d-glucoseIsomerase，并固定化該細(xì)胞以同時(shí)生產(chǎn)塔格糖和果糖，兩酶的最佳pH都為7.5，最適反應(yīng)溫度分別為80和85℃。經(jīng)過8次重復(fù)利用后，該細(xì)胞中兩種酶活仍保持70%以上，單批轉(zhuǎn)化率為果糖10%，塔格糖20%。當(dāng)前第27頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)DeokKunOh等人篩選出了兩個(gè)對(duì)源自G.stearothermophilusAI的pH有影響的突變點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行突變，突變酶Q408V和R408V的最佳pH值都從8.5改為7.5，最適條件下酶活分別提高60%和30%。GSAIR408VQ408V當(dāng)前第28頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)來源最適溫度（℃）最適pH半衰期（min）B.stearothermophilusUS100807.5-8.0110（75℃）Thermussp.608.5G.stearothermophilusT6707.0-7.552(80°C)Thermotogamaritima907-7.5185(90°C)Thermotoganeapolitana857.0120(90°C)Bacillushalodurans507.5-8.020(70°C)Alicyclobacillusacidocaldarius

656.0-6.5當(dāng)前第29頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)國外主要研究熱點(diǎn)目前關(guān)于L-AI的研究主要集中在嗜熱菌，熱穩(wěn)定性酶有利于工業(yè)化生產(chǎn)。利用分子生物學(xué)手段對(duì)嗜熱菌L-AI進(jìn)行大量表達(dá)，提高產(chǎn)酶率。對(duì)嗜熱菌L-AI進(jìn)行分子水平的改造，如改變pH和酶活的突變等，以適合塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。當(dāng)前第30頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)室研究情況篩選得到一株產(chǎn)L-AI的植物乳桿菌。建立了體系，并對(duì)產(chǎn)酶體系進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)該酶進(jìn)行了分離純化，并研究了其性質(zhì)。最適溫度和pH值分別為60℃和7.0。存在的問題酶活不高。0.049U/mL酶熱穩(wěn)定性不高，在60℃時(shí)半小時(shí)失活50%。當(dāng)前第31頁\共有35頁\編于星期四\16點(diǎn)菌種酶活(U/mL發(fā)酵液）比酶活(U/mg蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)化率反應(yīng)溫度(℃)最適溫度(℃)pH出處RecombinantE.coli(Thermus.spIM6501)4.60.19(純酶)54%底物1g/L酶量40U反應(yīng)時(shí)間72h60658.0BiotechnologyLetters2003MutantsofGeobacillusthermodenitrificans0.42(單點(diǎn))0.57(雙點(diǎn))(純酶)55%和58%底物1.8g/L反應(yīng)時(shí)間6.7h65658.5BiotechnologyLetters2006RecombinantE.coli(Thermoanaerobactermathranii)

厭氧4.0(純酶)25%底物300g/L時(shí)間48h65657.0ApplMicrobiolBiotechnol2004RecombinantE.coli(Thermotoganeapolitana)15.56(以阿拉伯糖為底物)120(以阿拉伯糖為底物)68%底物1.8g/L時(shí)間20h80857.0FEMSMicrobiologyLetters2002RecombinantE.coli(BacillusstearothermophilusUS100)185(純酶)48%底物0.9g/L酶量555U(3mg)時(shí)間7h70807.5BiochimicaetBiophysicaActa2006LactobacillusplantarumSK-2厭氧菌0.0491.4(純酶)39%底物100g/L酶量120U時(shí)間96h35607.0WorldJMicrobiolBiotechnol2006當(dāng)