細胞生物學(xué)第3章細胞生物學(xué)研究方法

第三章細胞生物學(xué)研究方法教學(xué)目的、要求掌握各種顯微鏡的用途、幾種細胞組分的主要分析方法的原理及技術(shù)了解電子顯微鏡的觀察方法，細胞培養(yǎng)、細胞工程及顯微操作技術(shù)的基本原理。當前第1頁\共有83頁\編于星期四\21點本章內(nèi)容提要第一節(jié)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細胞組分的分析方法第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)第四節(jié)用于細胞生物學(xué)研究的模式生物(自學(xué))當前第2頁\共有83頁\編于星期四\21點

第一節(jié)

細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法當前第3頁\共有83頁\編于星期四\21點顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。光學(xué)顯微鏡以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源。電子顯微鏡以電子束為光源。當前第4頁\共有83頁\編于星期四\21點普通光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡

激光共聚焦掃描顯微鏡相差顯微鏡

微分干涉差顯微鏡倒置顯微鏡

—、光學(xué)顯微鏡技術(shù)當前第5頁\共有83頁\編于星期四\21點普通生物顯微鏡由三部分構(gòu)成：照明系統(tǒng)光學(xué)放大系統(tǒng)機械裝置原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡當前第6頁\共有83頁\編于星期四\21點分辨率N=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。分辨力數(shù)值不會小于0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設(shè)計倍數(shù)為1000X。指顯微鏡能分辨物體最小間隔的能力。0.61λ分辨率DN.sin（α/2）=當前第7頁\共有83頁\編于星期四\21點樣品的制作制片：固定（甲酫）、包埋（石蠟）切成厚約5μm的薄片以便觀察。染色：伊紅和美藍特異地與不同蛋白質(zhì)結(jié)合，品紅特異地顯示DNA的所在部位。當前第8頁\共有83頁\編于星期四\21點（二）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點：光源為短波光(紫外光)；有兩個特殊的濾光片；用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光當前第9頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第10頁\共有83頁\編于星期四\21點原理:利用一定波長的光,照射被檢樣品,激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出可見的熒光,視場中所見像主要是樣品的熒光映像.自發(fā)熒光:生物體內(nèi)有些物質(zhì)受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出的熒光.木質(zhì)素,葉綠素次發(fā)熒光:標本本身不發(fā)熒光，經(jīng)熒光染料處理后,那些對熒光染料有選擇性吸收的部分經(jīng)激發(fā)后發(fā)出的熒光.常用熒光物質(zhì)：酸性品紅，甲基綠，中性紅，EB等。當前第11頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第12頁\共有83頁\編于星期四\21點（三）激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量。當前第13頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第14頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第15頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第16頁\共有83頁\編于星期四\21點（四）、相差顯微鏡

相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。當前第17頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第18頁\共有83頁\編于星期四\21點相差顯微鏡的基本原理把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減小，提高反差。當前第19頁\共有83頁\編于星期四\21點（六）微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。更適合研究活細胞中較大的細胞器。當前第20頁\共有83頁\編于星期四\21點組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。（七）、倒置顯微鏡當前第21頁\共有83頁\編于星期四\21點(八)、當代顯微鏡的發(fā)展趨勢進入20世紀80年代以來，光學(xué)顯微鏡的設(shè)計和制作又有了很大的發(fā)展，其發(fā)展趨勢主要表現(xiàn)在，注重實用性和多功能方面的改進。在裝配設(shè)計上趨于采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體，從而操作靈活，使用方便。自動化與電子化當前第22頁\共有83頁\編于星期四\21點二、電子顯微鏡技術(shù)透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡當前第23頁\共有83頁\編于星期四\21點1.原理：以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2μm）。用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。（一）、透射電子顯微鏡當前第24頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第25頁\共有83頁\編于星期四\21點電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理

利用樣品對波長的吸光學(xué)0.2μm左右可見光收形成明暗反差和顏顯微鏡放大倍數(shù)1000×400-700nm玻璃不要求色變化100nm紫外光電子利用樣品對電子的顯微鏡0.1-0.2nm電子束

0.01-0.9nm

電磁要求

散射和透射形成明暗反差電鏡需要真空的原因:1.如果含有其他分子,會與電子發(fā)生碰撞,使電子散射,影響成像質(zhì)量,2.碰撞也會使電子束不穩(wěn)定,產(chǎn)生閃爍現(xiàn)象,3.灼熱的燈絲遇氣體易腐蝕和斷裂.當前第26頁\共有83頁\編于星期四\21點2、制樣技術(shù)超薄切片負染技術(shù)冰凍蝕刻當前第27頁\共有83頁\編于星期四\21點電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。超薄切片當前第28頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第29頁\共有83頁\編于星期四\21點Page59超薄切片技術(shù)主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步驟。當前第30頁\共有83頁\編于星期四\21點Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.當前第31頁\共有83頁\編于星期四\21點負染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria當前第32頁\共有83頁\編于星期四\21點NegativeStainedActin當前第33頁\共有83頁\編于星期四\21點冷凍蝕刻freeze-etching標本置于干冰（-78.5攝氏度）或液氮（-196攝氏度）中冰凍。用冷刀驟然將標本斷開，然后升溫，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后用次氯酸鈉將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。Page61當前第34頁\共有83頁\編于星期四\21點酵母細胞當前第35頁\共有83頁\編于星期四\21點掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結(jié)構(gòu)。（二）、掃描電子顯微鏡當前第36頁\共有83頁\編于星期四\21點工作原理

用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。當前第37頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第38頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第39頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第40頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第41頁\共有83頁\編于星期四\21點

三、掃描隧道顯微鏡

掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）

由Binnig等1981年發(fā)明，根據(jù)量子力學(xué)原理中的隧道效應(yīng)而設(shè)計。

利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等分子的原子布陣和某些生物結(jié)構(gòu)，如生物膜、細胞壁等的原子排列

當前第42頁\共有83頁\編于星期四\21點原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進行觀察。當前第43頁\共有83頁\編于星期四\21點STMimageofaDNAmolecule當前第44頁\共有83頁\編于星期四\21點第二節(jié)細胞組分的分析方法一、細胞離心技術(shù)二、細胞組分顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、特異核酸序列的定位與定性五、放射自顯影技術(shù)六、定量細胞化學(xué)分析技術(shù)當前第45頁\共有83頁\編于星期四\21點一、離心技術(shù)是分離細胞器及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機稱為高速離心機。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機。超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg。當前第46頁\共有83頁\編于星期四\21點1.差速離心Differentialcentrifugation特點：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體——核蛋白體?？蓪⒓毎鞒醪椒蛛x，常需進一步通過密度梯離心再進行分離純化。當前第47頁\共有83頁\編于星期四\21點LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation當前第48頁\共有83頁\編于星期四\21點2.密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞和細胞成分分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。當前第49頁\共有83頁\編于星期四\21點

速度沉降velocitysedimentation

用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。當前第50頁\共有83頁\編于星期四\21點等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分離密度不等的顆粒。特點：介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。力場比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。當前第51頁\共有83頁\編于星期四\21點Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation當前第52頁\共有83頁\編于星期四\21點二、細胞組分顯示方法組織化學(xué)或細胞化學(xué)染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色劑可同細胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，對某種成分進行定性或定位研究的技術(shù)。利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有機物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。當前第53頁\共有83頁\編于星期四\21點1.固定物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥?；瘜W(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。

步驟：當前第54頁\共有83頁\編于星期四\21點2.顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CuS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反應(yīng)：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。當前第55頁\共有83頁\編于星期四\21點金屬沉淀法Schiff反應(yīng)聯(lián)苯胺反應(yīng)脂溶染色法當前第56頁\共有83頁\編于星期四\21點E.茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。F.米倫（Millon）染色：顯示蛋白質(zhì)（紅色）酪氨酸殘基與氮汞試劑反應(yīng)當前第57頁\共有83頁\編于星期四\21點三、特異蛋白抗原的定位和定性1.免疫熒光技術(shù)Immunofluorescencetechnique：抗原-抗體特異結(jié)合與熒光標記技術(shù)相結(jié)合用于研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。用Alexa488標記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,DAPI染色(常規(guī)熒光顯微鏡照片，ShiQinghua等)當前第58頁\共有83頁\編于星期四\21點用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)當前第59頁\共有83頁\編于星期四\21點2.免疫電鏡技術(shù)Immuneelectronmicroscopy：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等用免疫電鏡方法,觀察到寇氏隱甲藻的多條凝集染色體和細胞中的金顆粒,并且細胞核內(nèi)、核膜上的金顆粒簇集相對于胞質(zhì)中相對集中,指示了ACA抗CJFD2003

當前第60頁\共有83頁\編于星期四\21點四、細胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性通常用*原位雜交：指用標記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或者在細胞中的位置的方法。當前第61頁\共有83頁\編于星期四\21點五、放射自顯影術(shù)用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。當前第62頁\共有83頁\編于星期四\21點1.流式細胞技術(shù)用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flowcytometer）。六、定量細胞化學(xué)分析技術(shù)當前第63頁\共有83頁\編于星期四\21點當前第64頁\共有83頁\編于星期四\21點2.顯微光譜分析技術(shù)細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線?？衫蔑@微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。當前第65頁\共有83頁\編于星期四\21點第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)一、細胞培養(yǎng)二、細胞工程當前第66頁\共有83頁\編于星期四\21點一、細胞培養(yǎng)(一)、細胞培養(yǎng)的基本概念(二)、動物細胞培養(yǎng)(三)、植物細胞培養(yǎng)(四)非細胞體系在細胞生物學(xué)研究的作用當前第67頁\共有83頁\編于星期四\21點(一)、細胞培養(yǎng)的基本概念選用最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。動物細胞的生存環(huán)境與植物細胞差別很大，因而二者的培養(yǎng)方法很不相同。當前第68頁\共有83頁\編于星期四\21點(二)、動物細胞培養(yǎng)1.基本概念原代細胞(primaryculturecell)

從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。有人也把培養(yǎng)的第2代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)細胞。有限細胞系(finitecellline)從原代細胞群中篩選出的仍保持原來染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制性，能夠繁殖40-50代左右的傳代細胞。當前第69頁\共有83頁\編于星期四\21點永生細胞系(infinitecellline)

細胞發(fā)生遺傳突變，并帶有癌細胞的特點，可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱為永生細胞系。如：HeLa細胞系、BHK21細胞系、Vero細胞系、CHO細胞系細胞株：具有特殊遺傳標記或性質(zhì)的細胞群體。當前第70頁\共有83頁\編于星期四\21點（二）動物細胞培養(yǎng)2.體外培養(yǎng)細胞的類型：原代培養(yǎng)細胞傳代細胞：適應(yīng)在體外持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞3.細胞培養(yǎng)的類型單層細胞培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)4.細胞的形態(tài)：成纖維樣細胞、上皮樣細胞當前第71頁\共有83頁\編于星期四\21點原代培養(yǎng)當前第72頁\共有83頁\編于星期四\21點（二）植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)主要有如下幾種技術(shù)：原生質(zhì)體培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)當前第