藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證()

藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證()第一頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二目的和要求1、掌握定量分析方法驗(yàn)證的主要內(nèi)容；2、熟悉生物藥品前處理的主要方法；3、了解生物樣品的富集方法。第二頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的方法適合于相應(yīng)樣品分析的要求。在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證；藥品生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分改變或原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需要驗(yàn)證。方法驗(yàn)證過(guò)程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草或修訂說(shuō)明中。第四頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證（續(xù)1）需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目有：鑒別試驗(yàn)；雜質(zhì)定量或限度檢查；原料藥或制劑中有效成分的含量測(cè)定；以及制劑中其他組份（如防腐劑等）的測(cè)定。藥品溶出度、釋放度等檢查中，其溶出量等的測(cè)試也要做驗(yàn)證。第五頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證（續(xù)2）驗(yàn)證內(nèi)容有：準(zhǔn)確度；精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）專屬性檢測(cè)限、定量限線性、范圍耐用性等。第六頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、準(zhǔn)確度（Accuracy）準(zhǔn)確度是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率(%)表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的“范圍”內(nèi)測(cè)試?！胺秶敝傅氖谴_定的測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。用于定量測(cè)定的分析方法均需做準(zhǔn)確度驗(yàn)證第七頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、準(zhǔn)確度（續(xù)1）（一）含量測(cè)定方法1、原料藥的測(cè)定原料藥可用已知純度的對(duì)照品或供試品進(jìn)行測(cè)定；或用本法測(cè)定供試品的結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。計(jì)算公式：第八頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、準(zhǔn)確度（續(xù)2）如果該分析方法已經(jīng)測(cè)試，并求得其精密度、線性和專屬性，在準(zhǔn)確度可以推算出來(lái)的情況下，準(zhǔn)確度可以不用再驗(yàn)證。2、制劑的含量測(cè)定主要測(cè)試制劑中其他組份及輔料對(duì)含量測(cè)定方法的影響?？捎煤阎勘粶y(cè)物的制劑各組分（包括制劑輔料）進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算公式同原料藥的方法。第九頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、準(zhǔn)確度（續(xù)3）如果不能獲得制劑的全部組分，則可向制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，回收率計(jì)算公式為：中藥分析回收率測(cè)定常采用此法，一般要求在95～105%之間。若有些方法操作步驟繁多，可要求在90～110%。RSD一般在3%以內(nèi)。第十頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、準(zhǔn)確度（續(xù)4）制劑含量測(cè)定時(shí)要考慮輔料的影響，要盡量除去輔料的空白影響。制劑分析中，要求從自行制定的模擬樣品開(kāi)始，要求至少高、中、低三個(gè)濃度，每個(gè)濃度3份樣品，共9個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。一般儀器分析要求回收率的RSD為2%之內(nèi)，而容量分析要可達(dá)到99.7～100.3%。對(duì)于生物樣品分析，要求可以適當(dāng)放寬第十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、準(zhǔn)確度（續(xù)5）（二）雜質(zhì)含量測(cè)定方法多采用色譜法?；厥章实臏y(cè)定可通過(guò)向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。第十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、準(zhǔn)確度（續(xù)6）（三）數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。如設(shè)3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率（%）計(jì)算值，或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）或可信限。第十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、精密度（Precision）精密度系指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。一般至少用6次結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)精密度。精密度是考察分析方法在不同的時(shí)間、操作人員、實(shí)驗(yàn)室等所得結(jié)果的重現(xiàn)性和重復(fù)性。涉及含量測(cè)定的項(xiàng)目（含量測(cè)定和雜質(zhì)定量）都需要驗(yàn)證精密度。第十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、精密度（續(xù)1）偏差（d）：測(cè)量值與平均值之差標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（SD或S）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（RSD）第十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、精密度（續(xù)2）（一）驗(yàn)證內(nèi)容精密度驗(yàn)證包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性1、重復(fù)性：在較短時(shí)間間隔內(nèi)，在相同操作條件下，由同一分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性，也稱批內(nèi)精密度。測(cè)定時(shí)，可采用3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度3份供試品，共9個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。也可以采用同一個(gè)濃度，用6個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。第十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、精密度（續(xù)3）2、中間精密度在同一實(shí)驗(yàn)室，由于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件的改變，如不同時(shí)間、不同分析人員，用不同設(shè)備測(cè)定所得結(jié)果的精密度，稱為中間精密度。3、重現(xiàn)性在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度，稱為重復(fù)性。重現(xiàn)性只有當(dāng)方法被法定標(biāo)準(zhǔn)采納時(shí)需要做第十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第二十頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二三、專屬性（Specificity）專屬性是指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在情況下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性。能反映該方法在有共存物時(shí)對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力，也是用于復(fù)雜樣品分析時(shí)相互干擾程度的度量。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定等均應(yīng)考察專屬性。如果方法的專屬性不夠好，需要采用多個(gè)方法進(jìn)行補(bǔ)充。第二十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第二十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二三、專屬性（續(xù)1）（一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分。不含被測(cè)成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均應(yīng)成負(fù)反應(yīng)。（二）含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定應(yīng)用色譜法時(shí)，應(yīng)附代表性圖譜并應(yīng)標(biāo)明諸成分在圖中的位置，以說(shuō)明專屬性，其中分離度應(yīng)符合要求（>1.5）。第二十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二三、專屬性（續(xù)2）對(duì)于可獲得雜質(zhì)情況下，可通過(guò)加入雜質(zhì)的方式，看雜質(zhì)是否可得到有效分離。對(duì)于雜質(zhì)不能獲得的情況，可與其他已經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行比較。必要時(shí)采用光二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行純度檢查。第二十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第二十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二四、檢測(cè)限（LimitOfDetection，LOD）檢測(cè)限是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或量。反映了方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白值的高低。LOD是一種限度檢查效能指標(biāo)，無(wú)須準(zhǔn)確定量，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可藥品的鑒別試驗(yàn)和雜質(zhì)檢查方法均應(yīng)驗(yàn)證LOD第二十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二四、檢測(cè)限（續(xù)1）（一）常用方法1、目視法用含已知濃度被測(cè)物的試樣進(jìn)行分析，目視確定能被可靠地檢測(cè)出的被測(cè)物最低濃度或量。該法通常為儀器分析法中LOD的確定。2、信噪比法用已知濃度的樣品信號(hào)與空白樣品的信號(hào)進(jìn)行比較。一般以信噪比S/N=3時(shí)確定LOD。第二十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第二十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二五、定量限（limitofquantitation，LOQ）LOQ是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)該具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。LOQ的方法與LOD相似，只是信噪比一般要大得多，其S/N=10。也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定。第二十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二六、線性（Linearity）線性系指在設(shè)計(jì)的“范圍”內(nèi)，測(cè)試結(jié)果（響應(yīng)值）與樣品中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。應(yīng)在規(guī)定的“范圍”內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試樣品的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5個(gè)濃度的樣品。以測(cè)得的響應(yīng)值作為Y，藥物濃度為X，先作圖；然后用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。必要時(shí)，將響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)字換算后再計(jì)算。第三十頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二六、線性（續(xù)1）一般要求回歸方程的相關(guān)系數(shù)越接近于1，表明線性關(guān)系越好。但對(duì)于生物樣品來(lái)說(shuō)，要求會(huì)低些。數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。第三十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二七、范圍（Range）范圍系指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)范圍也有不同要求：對(duì)原料藥和制劑，范圍為80～120%；制劑含量均勻度為70～130%，也可以根據(jù)劑型特點(diǎn)適當(dāng)選擇。如果規(guī)定了限度范圍，一般為上限的+20%到下限的-20%。第三十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二七、范圍（續(xù)1）首先給定濃度范圍，即樣品濃度（或質(zhì)量）取值的最大和最小值，也是分析時(shí)樣品濃度（質(zhì)量）的上限和下限；線性指的是在給定范圍內(nèi)樣品測(cè)定信號(hào)與其濃度之間成正比的程度。一般以作圖的方式或者回歸方程的形式表示。線性與范圍一般不分開(kāi)。第三十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二八、耐用性（Robust）耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為使方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開(kāi)始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫(xiě)明。指的是對(duì)于影響條件變化時(shí)的適應(yīng)程度，應(yīng)盡可能的寬松，有一定的緩沖能力。第三十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二八、耐用性（續(xù)1）典型的變動(dòng)因素有：被測(cè)溶液的穩(wěn)定性，樣品提取次數(shù)、時(shí)間等。液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有：流動(dòng)相的組成和pH值，不同廠牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱，柱溫，流速等。經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說(shuō)明小的變動(dòng)能否通過(guò)設(shè)計(jì)的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確保方法有效。第三十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二方法學(xué)驗(yàn)證的選擇精密度準(zhǔn)確度檢測(cè)限定量限專屬性線性范圍耐用性鑒別試驗(yàn)：

雜質(zhì)含量測(cè)定：

溶出度和藥物釋放度：

生物樣品含量測(cè)定：

雜質(zhì)限度檢查：原料藥主要成分含量測(cè)定：

制劑中主要成分含量測(cè)定：

第三十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第四節(jié)生物樣品分析方法的基本要求生物樣品的前處理非常重要，除少數(shù)情況下樣品經(jīng)簡(jiǎn)單處理后進(jìn)行測(cè)定外，大部分情況下都需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，即進(jìn)行分離、純化和富集等，必要時(shí)還需要對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行衍生化處理，以滿足分析目的和定量分析方法的各種要求。第三十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、常用樣品的種類、采集和貯藏生物樣品包括各種體液和組織，最常見(jiàn)的是血液樣品，其次是唾液和尿液，在做組織分布時(shí)組織樣品也很常用。（一）血樣（二）唾液（三）尿液第四十頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）血樣（Blood）血樣包括血漿、血清和全血。血藥濃度主要指血漿或血清中的藥物濃度，而不是全血中的藥物濃度。一般認(rèn)為，當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡時(shí)，血漿中的藥物濃度能夠反映藥物在體內(nèi)靶器官的濃度（但可反映多少呢？），因而常把血漿藥物濃度作為體內(nèi)藥物濃度的測(cè)定指標(biāo)。第四十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）血樣（續(xù)1）血樣的采集：對(duì)于患者來(lái)說(shuō)，通常采用靜脈取血方式；對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)，可以采用更靈活的方式，如靜脈、動(dòng)脈、心臟等。一般不能取太多血樣的制備：全血：取全血后，加入凝血?jiǎng)ǜ嗡?、枸櫞酸鈉等）防止凝結(jié)，不進(jìn)行離心操作。第四十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第四十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）血樣（續(xù)2）血漿（Plasma）的制備：將加了抗凝劑的全血混勻后，以2500～3000RPM離心5～10min，使得血漿與血細(xì)胞分離，其中的淡黃色上清液即為血漿。血清（Serum）的制備：將采集的血樣在室溫下放置0.5～1hr，帶血液凝固后，用玻璃棒輕輕剝離雪餅，然后以2000～3000RPM離心5～10min，分取上層的淡黃色液體即為血清。第四十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第四十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）血樣（續(xù)3）血漿與血清相比，它們的藥物濃度測(cè)定值基本相同，但是血漿分離的比較快，而且制取的量約為全血的50%~60%（血清只為全血的20%~40%），多數(shù)研究者用血漿進(jìn)行分析測(cè)定。若血漿中含有的抗凝劑對(duì)藥物濃度測(cè)定有影響時(shí)，則應(yīng)使用血清樣品。血樣主要用于藥物動(dòng)力學(xué)、生物利用度等研究及臨床治療藥物濃度監(jiān)測(cè)等需要知道相對(duì)確切藥物濃度的分析中。第四十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）血樣（續(xù)4）血樣采取后，應(yīng)及時(shí)分離血漿和血清，否則血細(xì)胞破裂而發(fā)生溶血，導(dǎo)致藥物與各種蛋白等結(jié)合，致使無(wú)法測(cè)定。如果可以，最好及時(shí)分析血樣。若不能立即測(cè)定，需要放置試管中密塞保存。短期（一周內(nèi)）可放在冰箱中保存（4度左右），長(zhǎng)期保存需在-20或-80度冷等保存。全血不宜低溫冷凍保存。第四十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）唾液唾液的分泌量相對(duì)較大，而且其獲取較血液容易得多，而且有些藥物的唾液濃度與血漿濃度密切相關(guān)，所以有時(shí)也采用唾液進(jìn)行測(cè)定。唾液的采集應(yīng)在安靜狀態(tài)下，漱口15min后采集。采集后去掉泡沫部分，然后在3000RPM離心10min，取上清液使用。唾液采集后，應(yīng)在4度以下保存。在解凍時(shí)，需要充分?jǐn)噭蚝笫褂?，避免濃度不均勻。第四十八?yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第四十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（三）尿液藥物的清除主要通過(guò)尿液排出。尿液中可存在藥物的原形、代謝物和綴合物等，濃度高，量大，采集方便。但尿液中藥物濃度變化較大。所以，其應(yīng)用的目的與血樣有區(qū)別，主要在藥物劑量回收、腎清除率、生物利用度以及藥物代謝等方面的研究。尿的主要成分是水、尿素和各種鹽類等。不宜長(zhǎng)期放置，而且需要加入防腐劑保存。第五十頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二第五十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（三）尿液（續(xù)1）尿液濃度與血漿濃度沒(méi)有明顯的相關(guān)性。受到腎功能的影響比較大。一般收集采用自然排尿的方式，包括時(shí)尿、晨尿等幾種形式。測(cè)量每次收集的尿液體積，分別或集中收集（集中收集應(yīng)測(cè)量總體積），加防腐劑后保存。第五十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、生物樣品分析前處理技術(shù)生物樣品的前處理，需要考慮到如下幾方面：生物樣品的種類；被測(cè)物的性質(zhì)、存在形式和濃度范圍；所采用的測(cè)定方法。第五十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、生物樣品分析前處理技術(shù)（續(xù)1）1、生物樣品的種類生物樣品的種類不同，需要進(jìn)行處理的過(guò)程也有差異。血漿和血清需要去除蛋白質(zhì)的干擾，使得藥物才蛋白質(zhì)結(jié)合物中釋放出來(lái)；唾液樣品相對(duì)簡(jiǎn)單，離心去除粘蛋白即可；尿液常用酸或酶水解使得藥物從綴合物中分離出來(lái)。第五十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、生物樣品分析前處理技術(shù)（續(xù)2）2、被測(cè)藥物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及存在形式和濃度范圍等都對(duì)前處理有直接影響。藥物的酸堿性與溶解性涉及到藥物的萃取手段是否具有揮發(fā)性等可以考慮GC的分析；光譜特性和官能團(tuán)性質(zhì)涉及是否需要衍生化；濃度的高低也需要處理方法要求的高低等。第五十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、生物樣品分析前處理技術(shù)（續(xù)3）3、采用的測(cè)定方法不同，對(duì)于樣品前處理的要求也不同。HPLC方法對(duì)于去除蛋白是必須要求的；樣品濃度的高低也決定去除蛋白的方法也不相同；GC對(duì)于是否需要制備衍生物有要求；光譜分析法則需要為純物質(zhì)，所以要求更高；放射免疫法的專屬性很高，對(duì)于樣品的處理也相對(duì)簡(jiǎn)單得多。第五十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）蛋白質(zhì)的去除目的：使得藥物從結(jié)合型變成游離型，便于分析；減少后續(xù)處理過(guò)程中萃取時(shí)的乳化現(xiàn)象；保護(hù)儀器性能，避免造成損失，延長(zhǎng)壽命。常用方法：加入與水混溶的有機(jī)溶劑；加入中性鹽；加入強(qiáng)酸；加入含鋅鹽或銅鹽沉淀劑；酶解法。第五十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)1）1、加入與水相混溶的有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑的加入可以使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，從而使得藥物得以釋放出來(lái)。常用的有機(jī)溶劑有：乙腈、甲醇、丙酮和四氫呋喃等。常用的比例為：血漿/有機(jī)溶劑=1：1～1：3，可以去掉90%以上蛋白質(zhì)。用乙腈做沉淀劑效果較甲醇更好些。而離心時(shí)的速度需要達(dá)到10000RPM及其以上。第五十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)2）2、加入中性鹽：加入中性鹽，使得鹽濃度增加，蛋白質(zhì)脫水而沉淀。常用的中性鹽有：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽和枸櫞酸鈉等。常用比例為：血漿/飽和硫酸銨=1：2混合后，高速離心，可去除90%以上蛋白質(zhì)。常與有機(jī)溶劑萃取法聯(lián)用，以提高效率。第五十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)3）3、加入強(qiáng)酸：當(dāng)溶液的pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)為陽(yáng)離子狀態(tài)，可與酸根陰離子結(jié)合而形成沉淀析出。常用的強(qiáng)酸有10%的三氯乙酸（或三氟乙酸）等，比例為血漿/強(qiáng)酸=1：0.6左右混合，高速離心后，可去除90%以上蛋白質(zhì)。第六十頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)4）4、加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑：當(dāng)pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電荷的羧酸與金屬陽(yáng)離子形成不溶性沉淀常用的沉淀劑有：CuSO4和ZnSO4等，混合的比例為血漿/沉淀劑=1：2，然后高速離心。第六十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)5）5、酶解法：在測(cè)定某些與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固、且對(duì)算不穩(wěn)定的藥物時(shí)，常加入一些酶而使得蛋白質(zhì)分解，將藥物釋放出來(lái)。常用的是枯草菌溶素。但也可以根據(jù)藥物的不同選擇合適的分解酶。該法操作簡(jiǎn)單，效果較好。但很多酶的價(jià)格很高，且不易獲得是其缺點(diǎn)。第六十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）綴合物的水解藥物進(jìn)入體內(nèi)后，被免疫系統(tǒng)當(dāng)作異物而代謝掉，其中一些含有羥基、羧基、氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性的葡萄糖醛酸或葡萄糖酸酐等結(jié)合，形成極性大的無(wú)活性的綴合物。在測(cè)定尿液中藥物的總量時(shí)，需要用適當(dāng)?shù)姆椒ㄋ?，然后再進(jìn)行測(cè)定。其中酸水解法簡(jiǎn)便、快速，但專一性差、藥物易分解；酶水解法專一性較強(qiáng)、藥物無(wú)分解；但時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用大，對(duì)于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，可采用酶水解法。第六十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（三）有機(jī)破壞生物樣品中的金屬原子常與蛋白質(zhì)結(jié)合，難以用有機(jī)溶劑萃取，測(cè)定時(shí)多采取有機(jī)破壞的方法進(jìn)行，如使用硝酸-高氯酸作為消解劑，將有機(jī)部分破壞掉，使得金屬原子被轉(zhuǎn)變成高價(jià)態(tài)的離子部分。第六十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（四）分離、純化和富集樣品的濃度高低對(duì)于前處理的影響很大。如果樣品濃度較高（ug/ml及其以上），所采用的方法靈敏度可達(dá)到要求，那么樣品在簡(jiǎn)單處理（如沉淀蛋白或綴合物水解）后即可直接進(jìn)行測(cè)定。在很多情況下，生物樣品中藥物的濃度很低（ng/ml及其以下），很多儀器條件（如UV檢測(cè)）的靈敏度不夠，此時(shí)需要將樣品進(jìn)行分離、純化和富集，以達(dá)到分析的要求。第六十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（四）分離、純化和富集（續(xù)1）萃取法是應(yīng)用最多的分離、純化方法。目的是從大量樣品中提取出所需要的微量組分，然后通過(guò)溶劑的蒸發(fā)而使得樣品得到富集。萃取方法包括：液液萃取法：經(jīng)典方法；液固萃取法；發(fā)展迅速方法。第六十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二1、液液萃取法（LLE）液液萃取法（Liquid-Liquidextraction，LLE）適用于極性相對(duì)較小的藥物，由于這些藥物在有機(jī)溶劑中的溶解度（遠(yuǎn)遠(yuǎn)）大于在水相中的溶解度，而水相中的大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)極性較大，根據(jù)相似相溶原理，可以用有機(jī)溶劑將小極性藥物從水相中萃取出來(lái)，同時(shí)可以除去大部分的干擾物質(zhì)，包括大量蛋白質(zhì)等。該方法是傳統(tǒng)方法，仍在大量使用。第六十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二1、液液萃取法（續(xù)1）LLE需要考慮有機(jī)溶劑的特性、有機(jī)溶劑相和水相的體積，以及水相的pH值等。所選用的有機(jī)溶劑，要求對(duì)被測(cè)組分的溶解度大（能提取完全），沸點(diǎn)低（易于蒸發(fā)或揮發(fā)除去），與水不相混溶（容易分離）、無(wú)毒（苯類溶劑不要用）、化學(xué)穩(wěn)定（不易燃、不爆炸）、不易乳化（影響萃取效果）等。最常用的是乙醚和三氯甲烷（先難以購(gòu)買，可用二氯甲烷替代）。第六十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二1、液液萃取法（續(xù)2）所用的有機(jī)溶劑要適量，一般有機(jī)相與水相（液體樣品）的容積比為1：1或2：1，也可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行確定。如果有機(jī)溶劑體積過(guò)大，后續(xù)的揮發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)；體積過(guò)小，則可能提取不完全，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。第六十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二1、液液萃取法（續(xù)3）溶液的pH值對(duì)與LLE的影響非常大。多數(shù)藥物是親脂性的堿性藥物，內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，所以在堿性條件下提取藥物，可以使得藥物呈原型狀態(tài)而被易于提取出來(lái)，而內(nèi)源性物質(zhì)則留在水相中。可用適當(dāng)堿性溶液（如碳酸氫鈉-氫氧化鈉的混合液作為堿化試劑）一般情況下，有機(jī)溶劑的萃取只萃取一次。第七十頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二1、液液萃取法（續(xù)4）LLE的優(yōu)點(diǎn)是選擇性好，操作簡(jiǎn)單，成本低。大多數(shù)的藥物都可以與內(nèi)源性物質(zhì)得以分離，對(duì)結(jié)果的干擾較小。但該法不適合于極性大的藥物的分離和純化。第七十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二2、液固萃取法（LSE）液固萃取法（Liquid-Solidextraction，LSE）是近年來(lái)發(fā)展非常迅速的方法，主要采用柱色譜分離方法，將具有吸附、分配和離子交換性質(zhì)的固定相作成萃取小柱，將生物樣品通過(guò)此小柱，可以用適當(dāng)溶劑將干擾物洗脫掉，將藥物保留在固定相上，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵撓聛?lái)進(jìn)行分析。第七十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二2、液固萃取法（續(xù)1）LSE的特點(diǎn)：引入雜質(zhì)較少，樣品洗脫后可直接分析；消除在LLE中常見(jiàn)的乳化現(xiàn)象；萃取效率高，可用少量樣品進(jìn)行分析；最后洗脫多為以水為主的溶劑，安全性高；樣品處理速度快，對(duì)揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性藥物更合適；缺點(diǎn)是價(jià)格高，有時(shí)重復(fù)性差。第七十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二3、被測(cè)組分的富集樣品的萃取是一個(gè)去除雜質(zhì)的純化過(guò)程，但因?yàn)榇藭r(shí)有機(jī)溶劑的體積較大導(dǎo)致藥物的濃度較低，一般情況下不能直接用于分析。還需要進(jìn)一步的富集。富集的方法一般為：最后一次萃取的溶劑為小體積，使得藥物的濃度可達(dá)到分析方法的靈敏度；或者將有機(jī)溶劑揮發(fā)，然后再用小體積的合適的溶劑（如流動(dòng)相）復(fù)溶解后再分析。第七十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二3、被測(cè)組分的富集（續(xù)1）揮去萃取溶劑的常用方法是直接通入高純氮?dú)饬鞔蹈捎袡C(jī)溶劑，藥物保留在試管底部。因?yàn)榈獨(dú)獾男再|(zhì)不活潑，對(duì)于保護(hù)藥物不分解有幫助。如果藥物本身穩(wěn)定，也可以通入干凈的空氣流，以減少成本。對(duì)于遇氣流揮發(fā)或者遇熱不穩(wěn)定的藥物，可以用減壓法揮去溶劑（真空干燥箱），此法可同時(shí)處理多個(gè)樣品。溶劑蒸發(fā)時(shí)最好采用尖底玻璃試管，可使得少量溶劑富集在底部，便于吸取。第七十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二（五）化學(xué)衍生化衍生