北中大中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)03綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目-2銀翹散抗流感病毒有效組分研究_第1頁(yè)
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實(shí)驗(yàn)二銀翹散抗流感病毒有效組分研究銀翹散為清代醫(yī)家吳鞠通根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》“風(fēng)淫于內(nèi),治以辛涼,佐以苦甘;熱淫于內(nèi),治以咸寒,佐以甘苦”的理論而創(chuàng)制的名方,臨床應(yīng)用已久,由金銀花、連翹、牛蒡子、甘草、薄荷、荊芥、桔梗、淡豆豉、淡竹葉等9味藥組成。始見(jiàn)于1788年出版的《溫病條辯》?,F(xiàn)代用于治療流行性感冒、急性扁桃體炎、咽峽皰疹、麻疹、腮腺炎、乙腦、流腦、大葉性肺炎等疾病的初期階段?,F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明銀翹散具有良好的抗流感病毒活性。石任兵教授課題組以銀翹散全方為研究對(duì)象,按傳統(tǒng)用藥方式,結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),綜合運(yùn)用現(xiàn)代分離技術(shù)和方法,初步闡明了銀翹散抗流感病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ),并初步探討了其作用機(jī)理。一、銀翹散抗流感病毒有效組分群的篩選取銀翹散原方(金銀花:連翹:牛蒡子:甘草:薄荷:荊芥:桔梗:淡豆豉:淡竹葉為9:9:9:5:6:6:6:6:4)按傳統(tǒng)用藥方式,以水煎煮,得到水煎液。水煎液經(jīng)過(guò)AB-8型大孔樹(shù)脂柱處理,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選,以抗甲型、乙型流感病毒為活性評(píng)價(jià)指標(biāo),采用雞胚法和CPE法,篩選出了銀翹散抗流感病毒有效組分群(EFY)。二、銀翹散抗流感病毒有效組分群化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定采用多種分離純化方法和結(jié)構(gòu)鑒定手段,對(duì)銀翹散抗流感病毒有效組分群(EFY)中化學(xué)成分的系統(tǒng)研究,從中分離得到43個(gè)化合物,并對(duì)其中的31個(gè)進(jìn)行了鑒定。1個(gè)為新化合物,8個(gè)為首次從銀翹散中分得的已知化合物,其余為銀翹散各單味藥已有報(bào)道的化合物。1.儀器與試劑HMK顯微熔點(diǎn)儀(溫度計(jì)未校正)。TU1201型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和U2000紫外分光光度計(jì)。NicoletImpact410型紅外分光光度計(jì),KBr壓片。JEOL-300型核磁共振儀、VarianGemini-300型核磁共振儀和BrukerAVANC-EDRX-500超導(dǎo)核磁共振儀。VG-ZAB-HS型質(zhì)譜儀、VG-20-250型質(zhì)譜儀、Mariner質(zhì)譜儀和APEXⅡFT-ICR質(zhì)譜儀。XZ-7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(中國(guó)科學(xué)院生物物理所科龍儀器廠)。SHZ-3循環(huán)水真空泵(河南省鞏義市英峪電子儀器廠)。H66025超聲波清洗儀(無(wú)錫市超聲電子設(shè)備廠)。DS-Ⅱ電熱三用水箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)。WatersDeltaPerp3000制備液相色譜儀,Waters484可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器。Waters745數(shù)據(jù)記錄儀,流動(dòng)相:甲醇-水系統(tǒng)。Gilson制備液相色譜儀,Gilson306泵,Gilson118紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器,Gilson712化學(xué)工作站,流動(dòng)相:甲醇-水系統(tǒng)。薄層層析和柱層析硅膠(青島海洋化工廠出品)。薄層展開(kāi)系統(tǒng):氯仿-甲醇。Sep-hadexLH-20(上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠產(chǎn)品)。AB-8型大孔吸附樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠出品)。柱層析聚酰胺(上?;瘜W(xué)試劑公司出品)。聚酰胺-6-薄膜(浙江四青生化材料廠產(chǎn)品)。展開(kāi)系統(tǒng):甲醇一水(4:1)。顯色劑:10%硫酸乙醇溶液;1%三氯化鋁乙醇溶液。所用有機(jī)溶劑均為分析純。2.提取分離流程銀翹散抗流感病毒有效組分群(EFY)經(jīng)AB-8型大孔吸附樹(shù)脂處理,水-乙醇梯度洗脫,分別得到30%、50%、70%和95%乙醇部分。各部分分別經(jīng)聚酰胺柱層析,水-乙醇梯度洗脫,聚酰胺薄膜檢測(cè),合并相同組分.合并后的組分再行反復(fù)硅膠柱層析,氯仿-甲醇梯度洗脫;SephadexLH-20柱層析,甲醇-水不同比例洗脫;硅膠薄層制備,氯仿-甲醇系統(tǒng)展開(kāi);HPLC制備,甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相。最后從95%乙醇部分中得到4個(gè)單體化合物;從70%乙醇部分得到5個(gè)單體化合物;從50%乙醇部分得到18個(gè)單體化合物;從30%乙醇部分得到16個(gè)單體化合物。具體分離流程如下:3.銀翹散抗流感病毒有效組分群化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定通過(guò)對(duì)銀翹散抗流感病毒有效組分群(EFY)中化學(xué)成分的系統(tǒng)研究,從中分離得到43個(gè)化合物,經(jīng)理化常數(shù)測(cè)定及光譜解析,鑒定出其中的31個(gè)化合物,其中黃酮類17個(gè)、木脂素類3個(gè)、酚酸類5個(gè)和三萜類4個(gè),其它2個(gè)?,F(xiàn)以30%乙醇部分分得的化合物A為例說(shuō)明結(jié)構(gòu)鑒定的一般過(guò)程。A為黃色結(jié)晶性粉末,mp219-222℃,Mg-HCl反應(yīng)及Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性,酸水解檢出半乳糖,示為黃酮苷類化合物。FAB-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z465(M+l)和碎片峰m/z303(M-Gal+1),結(jié)合1H和13CNMR數(shù)據(jù)推斷分子式C21H32O12。據(jù)此計(jì)算不飽和度為12,推知A可能為單半乳糖苷。IR光譜(KBr)cm-1:3240(OH),1650(α,β-不飽和C=O),1600,1550,1496(苯環(huán))。1HNMR(DMSO-d6):δ:12.60(1H,s),10.81(1H,s),9.67(1H,s),9.10(1H,s)為四個(gè)酚羥基質(zhì)子信號(hào),其中δ12.60位5位羥基質(zhì)子信號(hào),因其與C=O形成氫鍵而大幅度移向低場(chǎng)。δ:7.65(1H,dd,J=8.4,2.4Hz),7.51(1H,d,J=2.4Hz),6.80(1H,d,J=8.4Hz)三組峰為苯環(huán)上的3個(gè)氫信號(hào),判斷其組成了1個(gè)ABX系統(tǒng),提示分子結(jié)構(gòu)中有三取代的苯環(huán)存在,是典型3',4'-二氧取代黃酮類化合物B環(huán)上的2',6'-H和5'-H質(zhì)子信號(hào)。δ:6.39(1H,d,J=2.1Hz),6.19(1H,d,J=2.1Hz)峰為苯環(huán)上的2個(gè)間位偶合的氫信號(hào),可歸屬于苷元A環(huán)的8-H和6-H,示A環(huán)為5,7-二氧取代。δ:5.36(1H,d,J=7.5Hz)為糖的端基質(zhì)子信號(hào),根據(jù)其偶合常數(shù)可知糖苷鍵為β構(gòu)型。13CNMR(DMSO-d6)δ:177.8(C-4羰基),δ:156.7(C-2),133.9(C-3),為典型的黃酮醇類骨架類型。同時(shí)也可觀察到糖的一組碳信號(hào),δ:102.2為糖端基碳信號(hào),δ:75.9,73.3,71.4,68.1,60.3是糖上其它碳信號(hào),經(jīng)與糖標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)對(duì)照,確定為β-D-半乳糖。結(jié)合1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù),推斷該化合物苷元為槲皮素。A的苷元部分與文獻(xiàn)相比13CNMRδ:C-2,C-3信號(hào)分別位移了+10和-2,說(shuō)明C-3位取代成苷。綜合上述各種結(jié)果,鑒定A為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷即金絲桃苷(hyperosid),其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1,全部碳?xì)湫盘?hào)歸屬見(jiàn)表1。圖1化合物A結(jié)構(gòu)式表1化合物A的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)No.δCδHNo.δCδH2156.71′121.43133.92′115.57.51(1H,d,J=2.4Hz)4177.83′144.85161.14′148.5698.66.39(1H,d,J=2.1Hz)5′116.37.51(1H,d,J=2.4Hz)7164.26′122.17.65(1H,dd,J=8.4,2.4Hz)893.96.39(1H,d,J=2.1Hz)1″102.25.36(1H,d,J=7.5Hz)9156.62″71.410104.23″73.33.1-3.7(10H,m,糖上其余6個(gè)C5-OH12.60(1H,s)4″68.1質(zhì)子和4個(gè)-OH質(zhì)子)C7-OH10.81(1H,s)5″75.9C3′-OH9.67(1H,s)6″60.3C4′-OH9.10(1H,s)三、單體化合物抗流感病毒活性測(cè)定對(duì)所得部分化合物按EFY活性篩選方法進(jìn)行了抗流感病毒活性測(cè)定。結(jié)果表明,所試的化合物中,大部分由于細(xì)胞毒性較大難以測(cè)定其活性,只有兩個(gè)化合物顯示出較好的抗流感病毒活性,且毒性較低,但兩者的抗流感病毒活性均不及EFY.由此也可以看出,中藥復(fù)方的藥效不僅僅依賴于某一個(gè)或幾個(gè)單體成分的作用,而應(yīng)是整體協(xié)同作用的結(jié)果。四、銀翹散抗流感病毒有效組分群質(zhì)量控制研究銀翹散組方中各單味藥的化學(xué)成分研究表明,其主要含有黃酮類、木脂素類、三萜類、揮發(fā)油類等,從銀翹散抗流感病毒有效組分群(EFY)化學(xué)成分的分離鑒定中也發(fā)現(xiàn)了大量的黃酮類和木脂素類成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃酮類和木脂素類具有良好的抗流感病毒活性,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),當(dāng)EFY經(jīng)聚酰胺處理時(shí),水洗部分與醇洗部分均顯示抗流感病毒活性,但作用不及EFY。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以確定在銀翹散抗流感病毒有效組分群中如此高含量的黃酮類和木脂素類成分就是其抗流感病毒的有效成分。為了更好的控制EFY的質(zhì)量,我們采用總成分和單體化合物共同測(cè)定作為質(zhì)量控制的定量指標(biāo)即采用比色法、紫外分光光度法及反相高效液相色譜法分別對(duì)EFY中的主要成分類別總黃酮和總木脂素以及主要指標(biāo)性成分醉魚(yú)草苷、異甘草素和牛蒡子苷進(jìn)行定量研究?,F(xiàn)以HPLC測(cè)定EFY中牛蒡子苷含量為例說(shuō)明定量分析的一般方法。1.儀器與試藥Waters515高效液相色譜泵,Waters2487DualλAbsorbance檢測(cè)器,Millen-nium32ChromatographyManager化學(xué)工作站;H66025型超聲清洗機(jī).牛蒡子苷(arctiin)對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)。銀翹散抗流感病毒有效組分群(EFY)。乙腈、甲醇為色譜純,水為重蒸餾水。2.對(duì)照品溶液制備對(duì)照品溶液的配制精密稱取牛蒡子苷對(duì)照品8.8mg,置于100ml容量瓶中,用甲醇完全溶解并稀釋至刻度,配制成0.088mg/ml的對(duì)照品溶液。3.樣品溶液的制備精密稱取EFY樣品約10.0mg,置于10ml容量瓶中,加適量50%乙腈溶液超聲使其完全溶解后加50%乙腈溶液定容至刻度。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,即得樣品溶液。4.色譜條件色譜柱:YWG-C18柱(250mm×4.6mm,10μm);流動(dòng)相:乙睛-水系統(tǒng)(25:75);流速:1.0ml/min;柱溫:室溫;紫外檢測(cè)器:0.08AUFS,檢測(cè)波長(zhǎng)278nm。5.方法與結(jié)果5.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取牛蒡子苷對(duì)照品適量,用甲醇溶解并稀釋,以甲醇為空白,在200-400nm掃描,證明牛蒡子苷在278nm處有較強(qiáng)的吸收。因此,選定278nm為測(cè)定的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。牛蒡子苷甲醇液紫外光譜圖見(jiàn)圖2。圖2牛蒡子苷甲醇液紫外光譜圖5.2流動(dòng)相的選擇選用C18柱,用不同比例的乙腈-水系統(tǒng)為流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)乙睛-水系統(tǒng)在(25:75)時(shí)分離效果較好,其保留時(shí)間適中,分離度亦符合要求。因此選定乙睛-水(25:75)為流動(dòng)相。樣品與對(duì)照品HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。圖3牛蒡子苷對(duì)照品(Ⅰ)、樣品EFY(Ⅱ)及陰性樣品(Ⅲ)HPLC色譜圖1牛蒡子苷5.3空白試驗(yàn)取按處方比例及工藝制得不含牛蒡子(牛蒡子苷)的陰性樣品,按“樣品溶液的制備”項(xiàng)下配制陰性樣品溶液,進(jìn)樣10μl,記錄色譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖3。表明處方中的其它成分不干擾牛蒡子苷的測(cè)定。5.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)根據(jù)色譜圖1-I計(jì)算,可得牛蒡子苷的理論塔板數(shù)(N)為5381;拖尾因子(T)為1.02。根據(jù)色譜圖1-Ⅱ計(jì)算,牛蒡子苷與其它成分分離良好即分離度R>1.5。5.5線性考察精密吸取對(duì)照品溶液2.5,5.0,7.5,10.0,12.5μl,按上述色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積值。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算牛蒡子苷回歸方程為Y=1.13×10-6X-9.50×10-3,r=0.9998。結(jié)果表明,牛蒡子苷在0.22-1.10μg范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。5.6精密度考察精密吸取同一對(duì)照品溶液10μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定牛蒡子苷色譜峰峰面積,計(jì)算峰面積RSD為0.33%,表明精密度良好。5.7穩(wěn)定性考察精密吸取樣品溶液10μl,分別于制備后0,2,4,6,8,10,12,24h進(jìn)樣,測(cè)定牛蒡子苷色譜峰峰面積,計(jì)算峰面積RSD為0.72%,表明樣品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。5.8重復(fù)性考察取同一批EFY樣品,按樣品溶液制備方法平行制備6份樣品溶液,分別進(jìn)樣10μl,測(cè)定牛蒡子苷色譜峰峰面積,計(jì)算牛蒡子苷平均含量為40.21mg/g,RSD為1.57%,表明該方法重復(fù)性良好。5.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量(牛蒡子苷含量為40.21mg/g)的樣品6份,每份約5mg,置于10ml容量瓶中,分別精密加入牛蒡子苷對(duì)照品溶液2.0ml(相當(dāng)于0.1760mg),按樣品溶液制備方法制備樣品溶液,分別進(jìn)樣10μl,測(cè)定牛蒡子苷色譜峰峰面積,根據(jù)計(jì)

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