第十章遺傳重組要

所謂遺傳重組指的是遺傳物質的重新組合，其共有的特征是DNA雙螺旋之間的遺傳物質發(fā)生交換。遺傳重組的存在確保了遺傳物質代與代之間基因組的重排，從而形成一個物種內部個體之間的遺傳差異。遺傳重組不僅僅發(fā)生于代與代之間，一個個體的基因組也可以發(fā)生重排。重組不只是在減數分裂和體細胞核基因中發(fā)生，也在線粒體基因間和葉綠體基因間發(fā)生。本文檔共71頁；當前第1頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第2頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第3頁；編輯于星期六\12點52分遺傳重組的證明本文檔共71頁；當前第4頁；編輯于星期六\12點52分突變和重組是提供進化起始物質的兩個過程。突變引起的遺傳改變能引起蛋白質中氨基酸序列的變化，該變化引起表型的改變，通過自然選擇發(fā)生作用。重組提供一個基因組結構的變化，也會引起表型的變化，也通過自然選擇發(fā)揮作用。本文檔共71頁；當前第5頁；編輯于星期六\12點52分根據不同的機制，可將重組分成4類：同源性重組（homologousrecombination）位點特異性重組（site-specificrecombination）轉座重組（transpositionrecombination）異常重組（illegitimaterecombination)本文檔共71頁；當前第6頁；編輯于星期六\12點52分第一節(jié)同源性重組同源性重組是發(fā)生在兩個DNA分子同源區(qū)之間的重組。同源性重組主要是利用DNA序列的同源性識別重組對象，由堿基序列提供識別的特異性。同源性重組最主要特征是相關的酶可以利用任何一對同源序列為底物。本文檔共71頁；當前第7頁；編輯于星期六\12點52分真核生物減數分裂時的染色體之間的交換，某些低等真核生物及細菌的轉化、轉導、接合，噬菌體的整合等都屬于同源性重組這一類型。在整個基因組中，同源重組的頻率并不恒定，并且跟染色體的結構有關。例如在異染色體附近遺傳物質的交換要受到抑制。本文檔共71頁；當前第8頁；編輯于星期六\12點52分一、進行同源重組的基本條件（1）在交換區(qū)具有相同或相似的序列發(fā)生同源性重組的兩個區(qū)域的核苷酸序列必須是相同或非常相似的。同源性重組常常只發(fā)生在兩個DNA分子中的相同部位。本文檔共71頁；當前第9頁；編輯于星期六\12點52分（2）雙鏈DNA分子之間互補堿基進行配對兩個DNA分子的鏈之間互補的堿基配對確保重組只發(fā)生在同樣的基因座之間。在該部位兩個雙鏈DNA分子通過鏈之間互補的堿基配對被維系在一起稱為聯(lián)會。本文檔共71頁；當前第10頁；編輯于星期六\12點52分（3）重組酶參與重組反應的酶保證重組的順利進行。重組過程中，每個分子的鏈首先斷裂，然后進行修復和連接，兩個DNA分子之間發(fā)生交換。重組完成后，重組分子的解離和釋放等過程均是在酶催化下進行的。本文檔共71頁；當前第11頁；編輯于星期六\12點52分（4）異源雙鏈區(qū)的形成同源性重組時，在兩個DNA分子之間互補堿基配對的區(qū)域稱為異源雙鏈區(qū)（heteroduplexregion）。兩個DNA分子通過一段異源DNA雙螺旋共價相互連接。本文檔共71頁；當前第12頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第13頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第14頁；編輯于星期六\12點52分二、同源性重組的分子模型第一個被廣泛接受的重組模型是1964年由RobinHolliday提出的Holliday模型。即將發(fā)生重組的兩個DNA分子同一個部位的兩個單鏈的斷裂，從而引發(fā)重組。兩個斷裂單鏈的游離端彼此交換，形成兩個異源雙鏈，然后末端連接形成Holliday連接體（HollidayJunction）。本文檔共71頁；當前第15頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第16頁；編輯于星期六\12點52分一旦Holliday連接體形成后，它能進行重排從而改變鏈的彼此關系。這種重排稱為異構化，因為在此過程中沒有鍵的割裂。一旦形成Holliday連接體后，就能被拆分。是否發(fā)生重組依賴于拆分時Holliday連接體的構象。本文檔共71頁；當前第17頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第18頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第19頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第20頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第21頁；編輯于星期六\12點52分Holliday模型被稱為雙鏈侵入模型，因為由于每一個DNA分子的一條鏈侵入到另一個DNA分子，它解釋了在重組時兩個DNA分子的異源雙鏈是如何形成的。Holliday連接體也能通過堿基之間氫鍵的斷裂和再連接而發(fā)生左右移動。這個過程稱為支鏈遷移（branchmigration)本文檔共71頁；當前第22頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第23頁；編輯于星期六\12點52分Holliday認為在DNA分子上存在某些位點，特殊的引發(fā)重組的酶能夠識別這些位點，確保兩條鏈在相同的部位被切斷。目前還沒有足夠的證據證明這些位點的存在。本文檔共71頁；當前第24頁；編輯于星期六\12點52分單鏈侵入模型單鏈侵入模型是對Holliday模型的修改。在該模型中，兩個DNA分子中的一個單鏈在隨機部位被切斷，然后暴露的末端侵入到另一個雙鏈DNA分子，發(fā)現它的互補序列以后將替代與它相同的鏈。然后DNA聚合酶將用留下的那條鏈作為模板，填充上侵入鏈所留下的缺口。被替代的鏈被降解，它的殘留末端與另一分子中新合成的DNA鏈相連接形成Holliday連接體。本文檔共71頁；當前第25頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第26頁；編輯于星期六\12點52分Holliday連接體形成以后，就會產生異構化然后拆分。單鏈侵入模型中，異源雙鏈首先只在兩個DNA分子中的一個形成。Holliday中間體形成以后通過支鏈遷移能夠在另一個DNA分子上產生異源雙鏈，這樣就解釋了異源雙鏈是如何形成的。本文檔共71頁；當前第27頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第28頁；編輯于星期六\12點52分雙鏈斷裂修復模型目前證明通過兩個DNA分子之中的一個雙鏈斷裂引發(fā)重組是個常見的機制。該模型認為參與重組的兩個DNA分子之一的兩條鏈被核酸內切酶切斷，然后在核酸外切酶作用下產生3’單鏈黏性末端。兩個3’游離末端之一侵入到另一個雙螺旋的同源區(qū)，置換“供體”雙螺旋的一個單鏈而形成一段異源雙鏈DNA，并同時產生一個D環(huán)（D-loop）。本文檔共71頁；當前第29頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第30頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第31頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第32頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第33頁；編輯于星期六\12點52分D環(huán)在DNA聚合酶的作用下修補而擴展，直至D環(huán)的長度與“受體”DNA雙螺旋缺口長度相當，互補的兩條單鏈退火。此時在缺口的兩側各有一段異源雙鏈DNA，兩個雜合雙螺旋之間為斷裂的缺口，并且此缺口為供體DNA序列所填充。缺口處雙鏈的完整性可以被以缺口3’端為起始的修補合成來修復。缺口是被兩次單鏈DNA的合成而修復的。本文檔共71頁；當前第34頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第35頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第36頁；編輯于星期六\12點52分第三節(jié)大腸桿菌重組的分子基礎在分子水平上，重組事件發(fā)生的先后順序是相似的：從一個已斷裂的分子中產生的單鏈與其對應的雙螺旋發(fā)生作用，配對區(qū)間擴展，重組中間體形成直到核酸內切酶解離此兩個雙螺旋分子。識別反應是重組機制的不可分割的重要部分，并且只涉及到DNA分子的特定區(qū)域而不是整個完整的染色體。本文檔共71頁；當前第37頁；編輯于星期六\12點52分一、chi位點和RecBCD核酸酶在λ噬菌體的一些突變種內，存在一些稱為chi的位點。chi位點單一的堿基對的改變即可激發(fā)重組的發(fā)生。這些位點皆含有一個恒定的非對稱的8bp序列：5’GCTGGTGC3’3’CGACCACC5’本文檔共71頁；當前第38頁；編輯于星期六\12點52分Chi位點是一個由基因recBCD編碼的RecBCD酶作用的靶部位。RecBCD酶是一種多功能酶，具有幾種不同的活性。它是一個強有力的降解DNA的核酸酶，早期被檢定為活性核酸外切酶V，具有解旋酶的活性。RecBCD所介導的解旋和切割可以被用來產生末端，并引發(fā)異源雙鏈的形成。本文檔共71頁；當前第39頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第40頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第41頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第42頁；編輯于星期六\12點52分二、RecA和Holliday連接體的形成RecA具有兩種相當不同的活性:RecA可以促進單鏈DNA與其在雙鏈DNA分子中互補的DNA鏈的堿基相配對。RecA還可以在SOS反應中激活蛋白酶。RecA需要單鏈DNA和ATP才能激活蛋白酶。本文檔共71頁；當前第43頁；編輯于星期六\12點52分RecA能夠利用由RecBCD在Chi位點附近切割所釋放的單鏈3’末端。RecA的DNA操作酶活性可以使一個單鏈DNA與雙螺.旋中的同源序列發(fā)生置換，這一反應被稱為單鏈攝取(single-stranduptake)或單鏈同化(single-strandassimilation)。本文檔共71頁；當前第44頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第45頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第46頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第47頁；編輯于星期六\12點52分三、Ruv蛋白和Holliday連接體的拆分大腸桿菌有一組由三個基因編碼與隨后的重組相關聯(lián)的蛋白。ruvA和ruvB基因的產物促進異源雙鏈的形成。RuvA蛋白可以識別Holliday連接體的結構，RuvB是一個腺苷三磷酸酶并可能提供支鏈遷移的動力。本文檔共71頁；當前第48頁；編輯于星期六\12點52分RuvA在交叉點處與DNA所有的4條鏈相結合，在交叉點的上游，兩個RuvB六聚體環(huán)狀結構分別與每個雙螺旋相結合。RuvAB蛋白復合體可以使支鏈以10～20bp的速度遷移。本文檔共71頁；當前第49頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第50頁；編輯于星期六\12點52分第三個基因ruvC編碼一種能夠特異性地識別Holliday連接體的核酸內切酶，此酶可以在體外切斷此種交叉而拆分重組中間體。一個含4個堿基的序列提供了RuvC拆分Holliday連接體的熱點。這一序列決定了拆分過程中哪一對DNA鏈被切斷，從而決定發(fā)生的是補丁型重組（patchrecombination）還是剪接型重組（splicerecombination）。本文檔共71頁；當前第51頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第52頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第53頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第54頁；編輯于星期六\12點52分第四節(jié)位點特異性重組位點特異性重組發(fā)生在特殊序列對之間，這一重組型式最早是在λ噬菌體的遺傳學研究中發(fā)現的。λ噬菌體有兩種存在型式：裂解狀態(tài)和溶源狀態(tài)。兩種類型間的轉換是通過位點特異性重組實現的。本文檔共71頁；當前第55頁；編輯于星期六\12點52分一、λ噬菌體DNA的整合與切除為了進入溶源狀態(tài)，游離的DNA必須整合（intergrate）到細菌DNA中去；而為了從溶源狀態(tài)向裂解狀態(tài)轉化，原噬菌體DNA則必須從細菌染色體DNA上切除（excise）。整合和切除均通過細菌DNA和λDNA上特定位點—附著點（attachmentsite，att）之間的重組而實現。本文檔共71頁；當前第56頁；編輯于星期六\12點52分細菌染色體上的附著點（attλ）稱為attB，含有B、O、和B’三個序列（BOB’）。突變后可以阻止λDNA的整合。λ噬菌體的附著位點稱attP，由P、O和P’三個序列組成。其中O序列是attB和attP所共有的，序列完全一致，稱核心序列（coresequence）.是位點特異性重組發(fā)生的地方。本文檔共71頁；當前第57頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第58頁；編輯于星期六\12點52分整合反應由λ噬菌體int基因的產物整合酶（integrase,Int）催化。Int是一種DNA結合蛋白，對POP’序列有強的親和力。整合反應還需要一種有大腸桿菌編碼的一種細菌蛋白，稱為整合宿主因子IHF(integrationhostfactor,IHF)。Int和IHF可以在體外進行位點特異性重組。本文檔共71頁；當前第59頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第60頁；編輯于星期六\12點52分切除反應發(fā)生在原噬菌體兩端的attL和attR之間，產物為λ噬菌體環(huán)狀DNA和細菌染色體DNA。催化切除反應的除了Int和IHF外，還需要一種叫做切除酶（exicisionase,Xis）的蛋白參加，該酶由λ噬菌體的cis基因編碼。Xis對控制反應方向起重要作用，它是切除反應所需要的，但卻抑制整合反應。本文檔共71頁；當前第61頁；編輯于星期六\12點52分整合和切除反應所需要識別的序列對不相同。整合要求對attB和attP之間進行識別，但切除要求對attL和attR識別。因此位點特異性重組的方向性特征由重組位點的特征所控制。整合和切除反應皆需Int和IHF蛋白。本文檔共71頁；當前第62頁；編輯于星期六\12點52分λ噬菌體DNA的整合機制

λDNA的整合涉及到attB和attP的核心序列DNA鏈的割裂和重接。首先在attB和attP位點上產生同樣的交錯切口，形成了5’-OH和3’-P的末端。5’單鏈區(qū)全長7個堿基。兩個核心區(qū)的斷裂完全相同，連接過程不需要任何新DNA的合成。在整合反應中，互補的單鏈末端交互雜和，連接并完成整合過程。本文檔共71頁；當前第63頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第64頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前第65頁；編輯于星期六\12點52分本文檔共71頁；當前