蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)相互作用本文檔共64頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期六\16點52分研究蛋白質(zhì)相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)并明確其相互作用的生物學(xué)意義蛋白質(zhì)相互作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質(zhì)相互作用的核心“種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反映了遺傳這樣一種本質(zhì)現(xiàn)象可研究對象合適的研究方法本文檔共64頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期六\16點52分研究蛋白質(zhì)相互作用需要微觀和宏觀的結(jié)合象與象的一部分本文檔共64頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期六\16點52分定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ)Input：10~20mgtotalproteinsIPsample：Immunoprecipitatedfrom1000mgoftotalproteins本文檔共64頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期六\16點52分定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ)Relativeexposurelevel本文檔共64頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期六\16點52分

研究蛋白質(zhì)相互作用的意義1、蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)。2、基因只是決定蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)才是發(fā)揮作用的主體。蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)揮其功能的主要活動。本文檔共64頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期六\16點52分穩(wěn)定相互作用形成蛋白質(zhì)復(fù)合體

（proteincomplex）瞬時相互作用（enzyme-substrate）生物學(xué)效應(yīng)穩(wěn)定的相互作用與瞬間的相互作用共同構(gòu)成蛋白質(zhì)相互作用的內(nèi)涵。本文檔共64頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期六\16點52分研究蛋白質(zhì)相互作用是為了研究相應(yīng)的生物學(xué)功能確定研究目標(biāo)尋找相互作用建立相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能體系本文檔共64頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期六\16點52分從蛋白質(zhì)相互作用到生物學(xué)功能。運用蛋白質(zhì)直接相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用的生物學(xué)意義。容易犯的錯誤：研究一大堆的蛋白相互作用，卻不知道這些相互作用有什么生物學(xué)意義。從物學(xué)功能到蛋白質(zhì)相互作用。通過改變生物學(xué)現(xiàn)象，分析蛋白質(zhì)間的遺傳相互作用，進一步研究相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。容易犯的錯誤：找到了平行變化的不相關(guān)蛋白質(zhì)。本文檔共64頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期六\16點52分發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用遺傳功能分析序列與結(jié)構(gòu)比較模擬驗證蛋白質(zhì)相互作用不同方法的交叉驗證不同生物體系中驗證本文檔共64頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期六\16點52分ProteininteractionAffinity:A+B=ABKd=[A][B]/[AB],Kd:dissociationconstantInteractionKdStreptavidin-biotinbinding10-14MAntibody-antigeninteraction(good)10-8-10-10MAntibody-antigeninteraction(weak)10-6MEnzyme-substrate10-6-10-10M蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用本文檔共64頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期六\16點52分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）本文檔共64頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期六\16點52分Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Westernblot：變性抗原，主要用于檢測蛋白質(zhì)的存在與否。免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用。免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特異性結(jié)合：Pr1－Ab－Pr2抗體篩庫：cDNA表達庫，抗體結(jié)合表達的蛋白質(zhì)，從而得到基因。已經(jīng)被質(zhì)譜和PCR所淘汰本文檔共64頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期六\16點52分Westernblot1、電轉(zhuǎn)移效率2、PVDF膜的充分浸潤3、轉(zhuǎn)移液中有太多的SDS4、膜的損壞5、轉(zhuǎn)移時膠和膜沒有完全接觸6、抗體的問題7、抗體的濃度太高或太低8、還原性物質(zhì)的存在9、封閉不充分本文檔共64頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期六\16點52分SDS－PAGEacrylamide的濃度蛋白質(zhì)上樣的量相鄰泳道的蛋白質(zhì)量、離子強度和樣品體積轉(zhuǎn)移膜：PVDF膜nitrocellulose膜抗體本文檔共64頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期六\16點52分免疫共沉淀免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特異性結(jié)合：Pr1－Ab－Pr2本文檔共64頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期六\16點52分免疫共沉淀12354抗體很差，Westernblot問題Loading比例不對樣品太多正確本文檔共64頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期六\16點52分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）本文檔共64頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期六\16點52分Affinityinteraction（親和作用）GSTpulldown：已知蛋白質(zhì)和GST融合，與細(xì)胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)。GSTtag。Biotin－Avidin結(jié)合：Biotin標(biāo)記已知蛋白質(zhì)，通過Avidin結(jié)合biotin標(biāo)記的蛋白質(zhì)，從而得到與biotin標(biāo)記蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)。優(yōu)點是biotin－avidin的結(jié)合是最牢靠的；缺點是細(xì)胞內(nèi)結(jié)合biotin的蛋白質(zhì)很多。各種不同的tag。許多本文檔共64頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期六\16點52分GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelution本文檔共64頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期六\16點52分GSTpulldownGSTfusionprotein不夠純，用作bait會產(chǎn)生太多的非特異性蛋白質(zhì)污染。本文檔共64頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期六\16點52分GSTpulldown本文檔共64頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期六\16點52分GSTPulldownbindingwashelution本文檔共64頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期六\16點52分Biotin－Avidin結(jié)合：生物界最穩(wěn)定的結(jié)合之一本文檔共64頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期六\16點52分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）本文檔共64頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期六\16點52分Yeasttwo-hybrid（酵母雙雜交）

發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)

鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用

確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團本文檔共64頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期六\16點52分lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ本文檔共64頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期六\16點52分發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)BDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因庫Marker2本文檔共64頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期六\16點52分確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白蘭白白本文檔共64頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期六\16點52分鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2蘭：相互作用白：不相互作用本文檔共64頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期六\16點52分Two-Hybrid的優(yōu)點：是酵母細(xì)胞內(nèi)的invivo相互作用。只需要cDNA，簡單。弱的相互作用也能檢測到。本文檔共64頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期六\16點52分Two-Hybrid的缺點：都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用。酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾。自身激活報告基因。都基因庫的要求比較高，單向1/3是inframe蛋白質(zhì)毒性。第三者Z插足介導(dǎo)的相互作用。假陽性。本文檔共64頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期六\16點52分lacZUASDBXlacZDBXAutoactivationBDXMarker1ADYlacZUASADYlacZADYMarker2本文檔共64頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期六\16點52分Phagedisplay（噬菌體展示）本文檔共64頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期六\16點52分Phagedisplay（噬菌體展示）Phagedisplay的最大優(yōu)點是數(shù)量大細(xì)胞：108~109細(xì)菌：1010Phage：1012尋找受體的配體7肽：8x1016本文檔共64頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期六\16點52分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）本文檔共64頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期六\16點52分SPRisusedtomonitorinteractionsoccurringinabiospecificsurfaceonametallayerbymeasuringchangesinthesoluteconcentrationatthissurfaceasaresultoftheinteractions.SurfacePlasmonResonance本文檔共64頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期六\16點52分本文檔共64頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期六\16點52分SPR優(yōu)點：無標(biāo)記、實時Label-freedetectionSRPdoesnotrequireanylabelsorreportergroupstodetectbiomolecularinteractions.Itfollowseverystepinamulti-stepanalysisprocedure,incontrasttolabel-basedmethodsthatoftenonlyreportthefinalstep.RealtimemeasurementTheprogressofinteractionsisdisplayeddirectly,asaplotofresponse(whichisdirectlyrelatedtoconcentrationchangesatthesurface)againsttime.Immediatefeedbackonthestatusofaninteractionspeedsupassaydevelopmentandanalysis.Theresultscanbeprocessedfurtheraftertherun,forexampletoextractkineticconstantsfortheinteraction.本文檔共64頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期六\16點52分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）本文檔共64頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期六\16點52分DonorAcceptor(2-10nm)

ExcitationfrequencyEmissionfrequency=Excitationfrequency

EmissionfrequencyFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)本文檔共64頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期六\16點52分Donorisexcitedatthemaximumabsorbancewavelength(380nanometers)ofthedonorAcceptorsignalisincreasedattheacceptoremissionmaximum(510nanometers)本文檔共64頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期六\16點52分ColordefiningGFPmutation(source)Blue(BFP)Y66HGreen(GFP)Y66WCyan(CFP)S65TYellowish(YFP)S65G,T203YRed(D.s.RFP)D.striataExcitation(max)382nm434nm488nm514nm558nmEmission(max)446nm476nm509nm527nm583nmSensitivitytophotobleachingHighLowLowModerateLowWavelengthoftheFluorescentProteins本文檔共64頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期六\16點52分本文檔共64頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期六\16點52分本文檔共64頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期六\16點52分本文檔共64頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期六\16點52分

Measureinteractionsbetweentwoproteinsin vivoVerysensitiveExcellentresolutionHelpfulincharacterizingmajorconformational changesinmacromoleculesDeterminetheinteractionqualitativelyand quantitativelyAdvantagesofFRET本文檔共64頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期六\16點52分LimitationsofFRETFRETonlyoccurswhenthetwofluorophoresarewithin2-10nmofeachother,whichmeansthatthefluorophoresmustbebroughttogetherviaverycloseprotein-proteininteractions.Requireexpensiveequipment.RequirelabelingofproteinsusingfluorophoreorGFPfusion本文檔共64頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期六\16點52分Proteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）有專門的課題加以介紹本文檔共64頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期六\16點52分研究蛋白質(zhì)相互作用的單分子技術(shù)：原子力相互作用本文檔共64頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期六\16點52分遺傳功能分析利用功能缺陷和互補來分析不同蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系。不是蛋白質(zhì)直接相互作用的證據(jù)，但可以提供進一步研究的目標(biāo)。本文檔共64頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期六\16點52分蛋白質(zhì)遺傳相互作用（geneticinteraction）是功能性相互作用有A：小量表達；有B：無表達；有C：無表達ABCABC本文檔共64頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期六\16點52分有A和B：表達增加；有A和C：小量表達；有B和C：無表達ABCABC本文檔共64頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期六\16點52分有A、B和C：高表達在A、B和C的蛋白質(zhì)復(fù)合體中，A是和基因調(diào)控區(qū)結(jié)合并有小的轉(zhuǎn)錄活性；B可以和A結(jié)合促進A的轉(zhuǎn)錄活性；C本身不能直接促進A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通過B的介導(dǎo)進一步促進轉(zhuǎn)錄。ABC本文檔共64頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期六\16點52分蛋白質(zhì)直接相互作用：從蛋白質(zhì)物理的相互作用到功能上的相互作用。蛋白質(zhì)遺傳相互作用：從功能上的相互