蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離分析

一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì)，具有特定的等電點(diǎn)（pI）。溶液pH＝pI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等；

pH＞pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；

pH＜pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。本文檔共45頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分等電點(diǎn)時(shí)特點(diǎn)：（1）凈電荷為零（2）一定離子強(qiáng)度的緩沖液：等離子點(diǎn)特征常數(shù)（3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點(diǎn)偏酸

堿性AA/酸性AA等電點(diǎn)胃蛋白酶0.21.0

血紅蛋白1.76.7

細(xì)胞色素C2.910.7

菊糖酶0.348.2（4）導(dǎo)電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。等電沉淀和蛋白電泳：

遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關(guān)本文檔共45頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分帶電粒子在電場中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。電泳：What’selectrophoresis?一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)本文檔共45頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負(fù)電荷或正電荷，故可在電場中發(fā)生移動(dòng)。不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動(dòng)速度也不同，據(jù)此可互相分離。一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)本文檔共45頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)1~100nm，處于膠體顆粒的范圍。（親水膠體）蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。1、蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)本文檔共45頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)2、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個(gè)重要因素：水化膜

通過氫鍵與水結(jié)合表面電荷

在非等電點(diǎn)狀態(tài)下，雙電層，帶同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。

本文檔共45頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用本文檔共45頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分3.蛋白質(zhì)凝膠凝膠作用：蛋白質(zhì)顆粒周圍的水膜是不均勻,使它們以一定的部位結(jié)合形成長鏈。這些長鏈又彼此結(jié)合成為復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠體。溶膠：蛋白質(zhì)作為分散相，水為連續(xù)相形成的溶液。凝膠：蛋白質(zhì)為連續(xù)相，水為分散相形成的網(wǎng)狀凝膠體。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)本文檔共45頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分3.蛋白質(zhì)凝膠凝膠具有脹潤作用：分類：（1）可逆性凝膠

（2）不可逆性凝膠部分破壞水化膜、適當(dāng)加熱和遠(yuǎn)離等電點(diǎn)4.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用滲析（透析）超濾二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)本文檔共45頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分三、蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性與凝固作用

在某些物理或化學(xué)因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞（肽鍵不斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。

What’sdenaturationofprotein?本文檔共45頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分1、變性理論

蛋白質(zhì)的變性就是天然蛋白質(zhì)分子中肽鏈的高度規(guī)則的緊密排列方式因氫鍵及其他次級(jí)鍵的破壞而變成不規(guī)則的松散排列方式。2、引起蛋白質(zhì)變性的因素：①物理因素：

高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波、機(jī)械攪拌②化學(xué)因素：

強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、尿素、胍、重金屬鹽等。變性的因素及作用機(jī)制本文檔共45頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分①物理性質(zhì)：

旋光性改變，溶解度下降，結(jié)晶能力下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學(xué)性質(zhì)：

官能團(tuán)反應(yīng)性增加，呈色反應(yīng)增強(qiáng)，易被蛋白酶水解。③生物學(xué)性質(zhì)：

原有生物學(xué)活性喪失，抗原性改變。

變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變本文檔共45頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分蛋白質(zhì)變性的可逆性－復(fù)性：某些蛋白質(zhì)變性后可以在一定的條件下重新形成原來的空間結(jié)構(gòu)，并恢復(fù)原來部分理化特性和生物學(xué)活性，這個(gè)過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）。蛋白質(zhì)變性的可逆性與復(fù)性蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下不能復(fù)性；如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞；或蛋白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu),并經(jīng)特殊處理則可以復(fù)性。本文檔共45頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分核糖核酸酶的變性與復(fù)性去除變性劑并緩慢氧化天然構(gòu)象尿素，-巰基乙醇變性狀態(tài)本文檔共45頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分蛋白質(zhì)變性的可逆性與復(fù)性

可逆變性：變性條件除去后仍可恢復(fù)天然狀態(tài)的變性。

不可逆變性：變性條件除去后不能恢復(fù)天然狀態(tài)的變性。本文檔共45頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分蛋白質(zhì)的熱變性與凝固作用1、熱變性

熱變性的定義熱變性三個(gè)階段影響熱變性的因素:

溫度、砂糖、H+濃度、蛋白質(zhì)含水量、電解質(zhì)；本文檔共45頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分蛋白質(zhì)的熱變性與凝固作用2、蛋白質(zhì)的凝固作用天然蛋白質(zhì)變性后，變性蛋白質(zhì)分子互相凝集或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象成為蛋白質(zhì)的凝固（coagulation）。凝固作用分兩個(gè)階段：

首先是變性；

其次失去規(guī)律性的肽鏈聚集纏繞在一起而凝固或結(jié)絮;本文檔共45頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用

理論上：研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能,分子量測定,亞單位拆分；

生產(chǎn)生活中有利的一面：食品加工，消毒滅菌等；非蛋白生物物質(zhì)提取純化，終止酶促反應(yīng)；

生產(chǎn)生活中不利的一面：活性蛋白制品（酶、抗體）的分離提取和保存；本文檔共45頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分外加一些因素去除蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素后，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀（precipitation）。1.What’sprecipitationofprotein?變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團(tuán)的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì)。四、蛋白質(zhì)的沉淀作用本文檔共45頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分2.沉淀種類：可逆與不可逆四、蛋白質(zhì)的沉淀作用3.沉淀方法：沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法本文檔共45頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分2.沉淀種類：可逆與不可逆四、蛋白質(zhì)的沉淀作用3.沉淀方法：沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法（1）鹽析－中性鹽沉淀法（2）有機(jī)溶劑沉淀法（3）酸沉淀法本文檔共45頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分（1）鹽析—中性鹽沉淀鹽溶作用鹽析作用What’ssaltprecipitationofprotein?蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法本文檔共45頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分（1）鹽析—中性鹽沉淀定義：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析（saltprecipitation）。作用機(jī)制:

中和電荷的同時(shí)破壞水化膜;What’ssaltprecipitationofprotein?蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法本文檔共45頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分常用的中性鹽：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時(shí)，pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好。鹽析沉淀蛋白質(zhì)通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。優(yōu)點(diǎn)鹽析應(yīng)用舉例（1）鹽析—中性鹽沉淀蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法本文檔共45頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分分段鹽析：

半飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較大的血漿球蛋白,而飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較小的血漿清蛋白。因此,使用不同濃度的硫酸銨溶液就可將分子量不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步分離。（1）鹽析—中性鹽沉淀本文檔共45頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。沉淀原理：①脫水作用——破壞水化膜；②使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。（2）有機(jī)溶劑沉淀法蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法本文檔共45頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分處理?xiàng)l件：①低溫操作；②沉淀完全后盡快分離；（2）有機(jī)溶劑沉淀法蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法機(jī)制：破壞電荷，等電點(diǎn)沉淀。（3）酸沉淀法本文檔共45頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分（1）重金屬鹽沉淀法（2）生物堿試劑沉淀法（除蛋白作用）（3）熱凝固沉淀法（4）抗體對(duì)抗原蛋白質(zhì)的沉淀3.沉淀方法：沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法四、蛋白質(zhì)的沉淀作用本文檔共45頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分沉降的概念沉降速率：v=dx/dt沉降常數(shù)與單位應(yīng)用：

沉降速度法測定分子量的原理；梯度離心分離蛋白質(zhì)（氯化銫）；五、蛋白質(zhì)的沉降作用本文檔共45頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)3.考馬斯亮藍(lán)G2504.福林酚試劑反應(yīng)5.黃色反應(yīng)--芳香族氨基酸的特有反應(yīng)6.米倫氏反應(yīng)—酪氨酸的特有反應(yīng)7.乙醛酸反應(yīng)—色氨酸的特有反應(yīng)8.坂口反應(yīng)—精氨酸特有的反應(yīng)本文檔共45頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色復(fù)合物含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣反應(yīng)肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深，粉紅，紫紅，藍(lán)紫受蛋白質(zhì)特異性影響小蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度本文檔共45頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)

靈敏度差。3.考馬斯亮藍(lán)G-250本身為棕色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高11000微克/毫升本文檔共45頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)4.福林酚試劑反應(yīng)酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)）福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸與雙縮脲法結(jié)合Lowry法在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物靈敏度提高100倍本文檔共45頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)5.黃色反應(yīng)--芳香族氨基酸的特有反應(yīng)濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)生成黃色化合物指甲、皮膚、毛發(fā)6.米倫氏反應(yīng)—酪氨酸的特有反應(yīng)酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色本文檔共45頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)7.乙醛酸反應(yīng)—色氨酸的特有反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸本文檔共45頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)8.坂口反應(yīng)—精氨酸特有的反應(yīng)精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)）精氨酸與α-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸定量測定精氨酸本文檔共45頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm

附近顯示強(qiáng)的吸收。可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測。蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）

=1.45A280—0.74A260本文檔共45頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\17點(diǎn)57分蛋白質(zhì)的分離純化本文檔共45頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\17點(diǎn)5