基因工程的基本操作步驟

關(guān)于基因工程的基本操作步驟第1頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三思考:利用大腸桿菌產(chǎn)生人胰島素的大致培育過(guò)程?

基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定第2頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子?，F(xiàn)代獲取方法：1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成初始目的基因的來(lái)源從生物中直接獲取人工合成第3頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。第4頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)例：基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一第5頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解例：基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一第6頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的主要區(qū)別

文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)

基因組文庫(kù)

文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第7頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需要的目的基因呢？第8頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量目的基因。第9頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三循環(huán)變性退火延伸第10頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第11頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子第12頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建-----------核心復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)志基因它們各自的作用是什么?第13頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)第14頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端第15頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第16頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化常用的受體細(xì)胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。第17頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化基因槍法花粉管通道法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第18頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植第19頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子第20頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過(guò)程:四、目的基因的檢測(cè)與鑒定第21頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三歸納步驟第22頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交技術(shù)方法:抗原抗體雜交②過(guò)程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA第23頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)—鑒定——①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原—抗體雜交第24頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、感受態(tài)細(xì)胞法DNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原—抗體雜交技術(shù)分子檢測(cè)外的個(gè)體水平鑒定第25頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三鞏固練習(xí):1.人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗生素抗性基因,該抗性基因的主要作用是()A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C.增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接2.在遺傳工程技術(shù)中,限制性?xún)?nèi)切酶主要用于()A.目的基因的提取和導(dǎo)入B.目的基因的提取和檢測(cè)C.目的基因與載體的結(jié)合和導(dǎo)入D.目的基因的提取與載體結(jié)合BD第26頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.1976年,美國(guó)的科學(xué)家首次將人的生長(zhǎng)抑制素釋放因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌,并獲得了表達(dá),此文中的表達(dá)是指該基因在大腸桿菌()A.能進(jìn)行DNA復(fù)制B.能傳遞給細(xì)菌后代C.能合成生長(zhǎng)抑制素釋放因子D.能合成人的生長(zhǎng)素C第27頁(yè)，講稿共29頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)