解脲支原體MB蛋白金標(biāo)檢測(cè)試劑盒（膠體金法）作業(yè)指導(dǎo)書

解脲支原體MB蛋白金標(biāo)檢測(cè)試劑盒（膠體金法）作業(yè)指導(dǎo)書1目的建立解脲支原體MB蛋白金標(biāo)檢測(cè)試劑盒（膠體金法）作業(yè)指導(dǎo)書，確保生產(chǎn)過程處于受控狀態(tài)。2范圍適用于解脲支原體MB蛋白金標(biāo)檢測(cè)試劑盒（膠體金法）相關(guān)工序的操作者。3職責(zé)3.1操作人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行本作業(yè)指導(dǎo)書。3.2生產(chǎn)主管負(fù)責(zé)監(jiān)督檢查。3.3質(zhì)檢部質(zhì)檢員負(fù)責(zé)抽查執(zhí)行情況。4工作內(nèi)容4.1生產(chǎn)工藝流程圖※膠體金制備膠體金制備★膠體金反應(yīng)膜檢測(cè)膠體金標(biāo)記膠體金反應(yīng)膜檢測(cè)膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)單克隆抗體制備單克隆抗體制備★貼板產(chǎn)品檢測(cè)裝卡分包質(zhì)量檢測(cè)切貼板產(chǎn)品檢測(cè)裝卡分包質(zhì)量檢測(cè)切條NC反應(yīng)膜檢測(cè)NC膜包被★NC反應(yīng)膜檢測(cè)NC膜包被抗原檢測(cè)解脲重組抗原的表達(dá)NC膜處理NC膜檢測(cè)※NC膜處理NC膜檢測(cè)入庫入庫抗體檢測(cè)兔抗鼠IgG抗體制備抗體檢測(cè)兔抗鼠IgG抗體制備注：※關(guān)鍵過程★特殊過程4.2作業(yè)內(nèi)容4.2.1膠體金制備（檸檬酸三鈉還原法）氯金酸（HAuCl4）水溶液放入三角瓶?jī)?nèi)加熱至沸騰→加熱檸檬酸三鈉溶液→混勻，攪拌煮沸10至15分鐘→待膠體金溶液顏色由藍(lán)→紫→紅，冷卻即可。4.2.2金標(biāo)抗體（反應(yīng)膜）制備以0.1M碳酸鉀溶液調(diào)膠體金溶液pH8.0-9.0→加入解脲支原體單抗，15分鐘后加入聚乙二醇→離心，調(diào)532nm測(cè)OD值5～10，方陣滴定法選定標(biāo)記工作濃度→用無紡布浸濕膠體金溶液，干燥、平整，檢測(cè)。4.2.3金標(biāo)抗體反應(yīng)膜質(zhì)檢將制備好的金標(biāo)抗體反應(yīng)膜按5‰比例抽檢，與標(biāo)準(zhǔn)反映膜匹配組裝成品，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)成品作如下對(duì)照檢測(cè)。a)符合率：樣品稀釋液、陰性質(zhì)控品無假陽，高、中、低濃度（0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml）支原體陽性質(zhì)控品均呈陽性。b）敏感度：最小檢出0.1μg/ml支原體陽性質(zhì)控品。c)反應(yīng)強(qiáng)度：+/+++（陽性反應(yīng)線/陰性反應(yīng)線）。d)反應(yīng)時(shí)間：30s～5min。確認(rèn)合格后才能轉(zhuǎn)入下一工序。4.2.4NC反應(yīng)膜制備親和性高分子硝酸纖維素膜→活化處理12小時(shí)→用水洗5次，每次20分鐘→室溫干燥后→取純解脲支原體MB蛋白單抗和兔抗鼠IgG抗體溶于10%CS中，濃度均為2mg/ml，用解脲支原體單抗在NC膜上包被衣原體陽性反應(yīng)線→用兔抗鼠IgG抗體在NC膜上包被陰性對(duì)照線→干燥后，用BS液封閉H2O清洗后，室溫干燥，備用。4.2.5NC反應(yīng)膜質(zhì)檢4.2.5.1常規(guī)圖形模式檢測(cè)：將制備好的反應(yīng)膜按5‰比例抽檢，與標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)抗體反應(yīng)膜匹配組裝成品，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)成品對(duì)照檢測(cè)；觀察陽性、陰性包被線及本底，要求圖形規(guī)則程度均勻，無遺漏或重復(fù)包被。4.2.5.2均一性，靈敏性和符合率篩選：按3%比例/批，隨機(jī)取樣，每張5～10人份，作陰性參比品和高、中、底（0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml）三個(gè)濃度的陽性參比品檢測(cè)，靈敏度解脲支原體最小檢出0.1μg/ml，無假陽性，均一性≥99%。4.2.6反應(yīng)體系組裝組裝材料材料規(guī)格（mm）組裝方式反應(yīng)膜（S1）20見圖1無紡布（S2）25，30吸水紙（S3）30金標(biāo)反應(yīng)膜（S4）10雙面膠帶（S5）29，48塑料墊板S678單面膠帶S7154.2.6.1反應(yīng)體組裝程序：a)在S6塑料基板上貼雙面膠帶S5（29，48mm）二條；b)在S5上貼反應(yīng)膜S1（20mm），S1上下緣距S6上下緣各29mm；c)在S6上貼吸水紙S3（30mm），吸水紙下緣與S1上緣交接1mm,上緣與S5的上邊緣對(duì)齊；d)在S5下端貼無紡布S2-1，其上緣壓住S1下緣1mm；e)在S2-1上平放金標(biāo)抗體反應(yīng)膜S4（10mm）上緣對(duì)齊；f)在S4上平放無紡布S2-2（30mm）上下緣分別S4、S6對(duì)齊；g)將組裝成型的反應(yīng)體系用電腦可調(diào)式切割機(jī)切成5mm測(cè)試條，裝入干燥器，待包裝。4.2.6.2成品包裝：每支成品先裝聚苯乙烯塑料外殼，再用鍍鋁膜包裝加干燥劑，附說明書，打批號(hào)入庫，每批留樣100人份，以備復(fù)檢．4.2.7質(zhì)控品制備4.2.7.1解脲支原體MB蛋白陽性質(zhì)控品取基因工程表達(dá)解脲支原體MB蛋白抗原，以樣品稀釋液（A液和B液1：1混合液）分別配成高、中、低（10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml）三個(gè)濃度，0.5ml/支分裝，-70℃保存。4.2.7.2解脲支原體MB蛋白陰性質(zhì)控品含0.1mg/ml牛血清白蛋白樣品稀釋液（A液和B液1：1混合液）,0.5ml/支分裝，-70℃保存。4.3成品檢測(cè)《解脲支原體MB蛋白金標(biāo)檢測(cè)試劑盒（膠體金法）》產(chǎn)品注冊(cè)標(biāo)要求。4.3.1外觀4.3.1.1要求a）檢測(cè)條：表面應(yīng)平整、無劃傷、開裂、變形及污漬；檢測(cè)卡各組分附著牢固、內(nèi)容齊全；b)檢測(cè)卡：外殼應(yīng)平整，上下蓋應(yīng)均勻合攏，無明顯間隙；反應(yīng)芯試條在外殼內(nèi)應(yīng)附著牢固；4.3.1.2檢驗(yàn)在自然光線下，用手感和目力觀察方法進(jìn)行檢驗(yàn)。4.3.2靈敏度4.3.2.1要求檢測(cè)卡可以測(cè)定出0.1μg/ml的解脲支原體MB蛋白，凡解脲支原體MB蛋白等于和高于該濃度時(shí)檢測(cè)線和對(duì)照線均顯色，而低于該濃度時(shí)檢測(cè)線不顯色，但無論任何濃度對(duì)照線均應(yīng)顯色。4.3.2.2測(cè)試a)試劑1)空白對(duì)照液：樣品稀釋液；2)測(cè)定樣品液：10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml，＜0.1μg/ml四個(gè)濃度的質(zhì)控品。b)測(cè)定方法隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取足量試樣對(duì)空白對(duì)照液和每個(gè)濃度的樣品液分別進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定重復(fù)測(cè)定10個(gè)檢測(cè)卡。測(cè)定時(shí)取約4滴處理好的樣品液在測(cè)試板右端的圓加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察測(cè)試板中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。c)結(jié)果以下結(jié)果為合格：測(cè)定空白對(duì)照液的試劑盒檢測(cè)線不顯色，只有對(duì)照線顯色。測(cè)定濃度≥0.1μg/ml解脲支原體MB蛋白樣品液的試劑盒檢測(cè)線和對(duì)照線均有顯色，且在測(cè)定閾值以上的檢測(cè)線色帶隨解脲支原體MB蛋白的濃度升高而色帶加深。4.3.3符合率4.3.3.1陰性符合率4.3.3.1.1要求試劑盒測(cè)試解脲支原體MB蛋白陰性質(zhì)控品10份，假陽性判斷結(jié)果不多于1份，符合率應(yīng)≥90%。4.3.3.1.2測(cè)試隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡，測(cè)定陽性質(zhì)控品10份。測(cè)定時(shí)取100μl陽性質(zhì)控品加在檢測(cè)卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.3.2陽性符合率4.3.3.2.1要求試劑盒測(cè)試解脲支原體MB蛋白含量高于0.1μg/ml的陽性質(zhì)控品10份，假陽性判斷結(jié)果不多于1份，符合率應(yīng)≥90%。4.3.3.2.2測(cè)試隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡，測(cè)定陰性質(zhì)控品10份。測(cè)定時(shí)取100μL陰性質(zhì)控品加在檢測(cè)卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.4重復(fù)性4.3.4.1陰性重復(fù)率4.3.4.1.1要求使用試劑盒檢測(cè)同一份陰性質(zhì)控品10次，同一份質(zhì)控品的陰性判定結(jié)果應(yīng)基本一致，假陽性判定結(jié)果不多于1份，陰性重復(fù)率應(yīng)≥90%。4.3.4.1.2測(cè)定隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡，測(cè)定時(shí)取100μl陰性質(zhì)控品加在檢測(cè)卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.4.2陽性重復(fù)率4.3.4.2.1要求使用試劑盒檢測(cè)同一份陽性質(zhì)控品10次，同一份質(zhì)控品的陽性判定結(jié)果應(yīng)基本一致，假陰性判定結(jié)果不多于1份，陽性重復(fù)率應(yīng)≥90%。4.3.3.2.2測(cè)定隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡，測(cè)定時(shí)取100μl陽性質(zhì)控品加在檢測(cè)卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.5精密性4.3.5.1要求每批試劑盒隨機(jī)抽取10個(gè)檢測(cè)卡樣品，用同一份陽性UU質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，要求各檢測(cè)卡的顯色應(yīng)均一。4.3.5.2測(cè)定隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定時(shí)取100μl陽性UU質(zhì)控品加在檢測(cè)卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.6穩(wěn)定性4.3.6.1要求a）在37Cb）在