流式細(xì)胞術(shù)（免疫學(xué)檢驗(yàn)課件）

流式細(xì)胞術(shù)前言流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)工具，通過檢測(cè)標(biāo)記的熒光信號(hào)，在功能水平上對(duì)懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。FCM檢測(cè)對(duì)象：細(xì)胞及其參數(shù)(如DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等)。FCM優(yōu)點(diǎn)：具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等。第一節(jié)FCM的檢測(cè)原理激光光電倍增管放大電路激光技術(shù)單克隆抗體技術(shù)細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)光電測(cè)量技術(shù)電子物理技術(shù)電子計(jì)算機(jī)技術(shù)能對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選（一）流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)

包括流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室

由樣品管、鞘液和噴嘴等組成，是流式細(xì)胞儀的核心組件，在這里待測(cè)樣品與激光相交。液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)包括壓縮空氣泵、壓力感受器、鞘液過濾器和樣品壓力調(diào)節(jié)器等。1.液流系統(tǒng)二、細(xì)胞分析原理

流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

作用：依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。

FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管鞘液管由激光光源、分色反光鏡、光速成形器、透鏡組和光電倍增管組成。流式細(xì)胞儀的測(cè)定是基于對(duì)光信號(hào)的檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)的，因此光學(xué)系統(tǒng)是流式細(xì)胞儀中最為重要的一個(gè)系統(tǒng)。2.光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析、存儲(chǔ)、顯示的重要組件，由計(jì)算機(jī)及相應(yīng)的軟件組成。作用：將產(chǎn)生的各種光信號(hào)成比例的轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，進(jìn)行數(shù)字化處理后轉(zhuǎn)入電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)參數(shù)前向散射光側(cè)向散射光熒光前向散射光檢測(cè)器

側(cè)向散射光檢測(cè)器

在激光束的正前方，又稱小角散射FSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的體積大小成正比，檢測(cè)的是細(xì)胞或其他顆粒的表面屬性在激光束的垂直方向，又稱90°散射SSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正比，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性前向散射光示意圖細(xì)胞大小側(cè)向散射光示意圖結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度血液白細(xì)胞散點(diǎn)圖淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞粒細(xì)胞熒光信號(hào)：由待檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激光激發(fā)后產(chǎn)生。特異性熒光探針與單克隆抗體結(jié)合后，與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的靶抗原結(jié)合，經(jīng)染色后的細(xì)胞在激光的照射下，熒光染料發(fā)出比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光，檢測(cè)熒光素信號(hào)的強(qiáng)弱就可以了解抗原表達(dá)量的多少。高度聚焦激光束

（二）細(xì)胞分析原理

單細(xì)胞懸液

特異性熒光染料標(biāo)記抗體染色流動(dòng)室檢測(cè)區(qū)

恒定氣壓鞘液噴出

高壓

細(xì)胞單行排列

特異性熒光

+散射光

入射光束與液柱垂直方向前向小角方向熒光信號(hào)

側(cè)向散射光信號(hào)

前向散射光信號(hào)

熒光檢測(cè)系統(tǒng)

散射光檢測(cè)系統(tǒng)

前向散射光感受器

光信號(hào)光信號(hào)電信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換

放大

細(xì)胞分析原理

不同光信號(hào)的轉(zhuǎn)換二、細(xì)胞分選原理

（一）分選的基本原理

流式細(xì)胞儀的分選是指從細(xì)胞群體中分離出感興趣的細(xì)胞，檢測(cè)的任意參數(shù)都可作為分選時(shí)指定的細(xì)胞的依據(jù)。分選的方式有捕獲式分選和電荷式分選，目前應(yīng)用最多的是電荷式分選。電荷式分選基本原理488nm激光+-前向散射光檢測(cè)器

熒光檢測(cè)器電磁場(chǎng)單個(gè)細(xì)胞被分類進(jìn)入檢測(cè)管流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)（二）FCM分選指標(biāo)

細(xì)胞分選對(duì)儀器的性能要求較高分選是流式細(xì)胞儀的重要功能之一分選功能的裝置較為復(fù)雜

分選指標(biāo)分選速度

分選純度

分選收獲率

三、流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)

速度快

對(duì)單個(gè)細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速、逐個(gè)檢測(cè)，測(cè)量速度可以達(dá)到每秒數(shù)千個(gè)甚至上萬個(gè)細(xì)胞靈敏度高

每個(gè)細(xì)胞上只需帶有1000～3000個(gè)熒光分子即能檢測(cè)出來多參數(shù)多色熒光染色同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞或生物顆粒的多種特征精度高

在細(xì)胞懸液中檢測(cè)細(xì)胞，比其他技術(shù)的變異系數(shù)更小，分辨率更高純度高

可以把指定特征的細(xì)胞分選出來，分選細(xì)胞的純度可達(dá)到99%以上無害性

能保持細(xì)胞不被破壞，進(jìn)行無害性定性或定量分析和分選（一）影響因素

溫度

pH值

非特異熒光固定劑

四、流式細(xì)胞術(shù)定量分析的注意事項(xiàng)

（二）質(zhì)量控制

環(huán)境要求

儀器校正

樣本要求

設(shè)置對(duì)照

數(shù)據(jù)的獲取和分析確保標(biāo)本上機(jī)檢測(cè)前的濃度為1×106/ml，細(xì)胞濃度過低可直接影響檢測(cè)結(jié)果。封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，尤其在間接免疫熒光標(biāo)記時(shí)必不可少。熒光抗體染色后需充分洗滌，注意混勻、低速離心，減少重疊細(xì)胞和細(xì)胞碎片。注意避光染色，保證細(xì)胞免疫熒光的穩(wěn)定。設(shè)置對(duì)照樣品，應(yīng)采用與抗體來源同型匹配的無關(guān)對(duì)照和熒光抗體的本底對(duì)照。判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意減去本底熒光，使免疫熒光的定量分析更準(zhǔn)確。（三）注意事項(xiàng)

第二節(jié)FCM的關(guān)鍵技術(shù)一、FCM單細(xì)胞標(biāo)本的制備

流式細(xì)胞術(shù)的測(cè)定樣本必須保證是單細(xì)胞懸液，這是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的最關(guān)鍵的第一步。單細(xì)胞懸液大多來自生物樣品，主要來源于培養(yǎng)細(xì)胞、血液、新鮮實(shí)體組織及石蠟包埋組織等，不同來源的樣本制備單細(xì)胞懸液的方法也不同。以某一類細(xì)胞群為檢測(cè)對(duì)象，因此為了減少檢測(cè)時(shí)的干擾因素，常常在測(cè)定前把某一細(xì)胞群（單核細(xì)胞或血小板）從血液分離出來，制成單細(xì)胞懸液再進(jìn)行標(biāo)記染色。制備單個(gè)核細(xì)胞懸液的最常用方法是單次密度梯度離心法（一）外周血單細(xì)胞懸液制備

（二）培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液制備

懸浮生長(zhǎng)

貼壁生長(zhǎng)

反復(fù)吹打

分散細(xì)胞

常規(guī)洗滌

低速離心

蛋白酶消化

機(jī)械吹打

細(xì)胞脫落

低速離心

漂洗重懸

單細(xì)胞懸液

培養(yǎng)細(xì)胞一般是以懸浮或貼壁的方式生長(zhǎng)將新鮮實(shí)體組織進(jìn)行單細(xì)胞懸液的制備是一項(xiàng)困難而復(fù)雜的技術(shù)。理想的狀態(tài)是既要達(dá)到分離細(xì)胞的目的又要不損傷細(xì)胞。

最常用的方法是酶消化法、機(jī)械法、化學(xué)處理法和表面活性劑處理法等。（三）新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備

該制備方法的建立擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍，有利于進(jìn)行臨床回顧性研究和利用。常用的方法有二甲苯脫蠟法、組織清潔劑脫蠟法和甲氧-雙氧水處理法。石蠟切片一般適宜厚度是40μm~50μm，脫蠟須徹底，獲取組織后，用酶進(jìn)行消化處理，消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以免細(xì)胞核被消化溶解，經(jīng)過濾、漂洗后即可獲得單細(xì)胞懸液。（四）石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液制備

FCM主要的信號(hào)參數(shù)包括散射光信號(hào)和熒光信號(hào)，熒光染色是保證熒光信號(hào)產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。目前間接免疫熒光染色已較少用；直接免疫熒光染色以雙色以上分析較為常用。單色免疫熒光多用于單克隆抗體特異性較高、單一細(xì)胞群的抗原檢測(cè)，多色免疫表型分析宜采用同一品牌的試劑。二、FCM樣品的熒光染色

（一）FCM常見熒光染料的種類和特性應(yīng)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對(duì)488nm波長(zhǎng)的激發(fā)光有較強(qiáng)的吸收能力發(fā)射光與激發(fā)光之間應(yīng)有較大波長(zhǎng)差容易與被標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合而不影響抗體自身的特異性。理想的熒光染料需要具備：常用熒光染料的特性和應(yīng)用熒光染料激發(fā)光(nm)發(fā)射光(nm)顏色應(yīng)用FITC488525綠色免疫熒光PE（RDI）488575橙色免疫熒光PE-Cy5488670紅色免疫熒光PE-Cy7488755深紅色免疫熒光ECD488620橙紅色免疫熒光PI488620橙紅色DNA染色APC633670紅色1.直接免疫熒光染色法

優(yōu)點(diǎn)

操作簡(jiǎn)單，方法簡(jiǎn)便、快速特異性強(qiáng)，與其他抗原交叉染色較少反應(yīng)中只有兩種因素（細(xì)胞與抗體）參與，結(jié)果判斷較簡(jiǎn)單（二）FCM熒光染色的主要方法一抗二抗2.間接免疫熒光染色法優(yōu)點(diǎn)

敏感性高具有更廣的通用性缺點(diǎn)

①操作步驟繁瑣，干擾因素較多②易產(chǎn)生非特異性染色，結(jié)果判斷有時(shí)比較困難多色標(biāo)記簡(jiǎn)便、省時(shí)、節(jié)約成本，但對(duì)操作人員的要求較高。試劑的選擇還需結(jié)合儀器的配置考慮。多色流式細(xì)胞儀的開發(fā)促進(jìn)了新的熒光染料的合成及抗體標(biāo)記物的發(fā)展。3.多參數(shù)分析時(shí)熒光抗體的組合標(biāo)記自發(fā)熒光：未經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞受到激光照射后所發(fā)出的熒光。每種細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光，如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等。自發(fā)熒光易引起信號(hào)干擾，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，在實(shí)際臨床檢驗(yàn)工作中應(yīng)注意區(qū)別。（三）自發(fā)熒光流式細(xì)胞儀測(cè)定樣品時(shí)，針對(duì)每個(gè)細(xì)胞都會(huì)記錄各個(gè)光電器件所采集的檢測(cè)信號(hào)，這些信號(hào)經(jīng)過模/數(shù)電路轉(zhuǎn)換后，全部結(jié)果傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中存儲(chǔ)并分析。目前所使用的流式細(xì)胞儀為了對(duì)獲取的數(shù)據(jù)更直觀地進(jìn)行觀察和分析，多用圖形化的方式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯示。第三節(jié)FCM的檢測(cè)分析方法

X軸代表一維參數(shù)。以通道表示，其與光強(qiáng)度之間的關(guān)系依放大器的性質(zhì)而定，通道右側(cè)信號(hào)的光強(qiáng)度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)光亮度越強(qiáng)。一、單參數(shù)直方圖

Y軸代表顆粒計(jì)數(shù)，反映相同熒光或散射光強(qiáng)度的顆粒相對(duì)數(shù)量的多少，可用于定性、定量資料的分析。單參數(shù)分析只能表達(dá)具有相同特性細(xì)胞數(shù)量與光信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系。

雙參數(shù)直方圖是一種細(xì)胞與雙測(cè)量參數(shù)的圖形，X軸與Y軸分別代表一種參數(shù)。雙參數(shù)信號(hào)常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的基本表示法是用點(diǎn)密圖來顯示。如果把一個(gè)散點(diǎn)圖分別投影到X軸和Y軸，可得到兩個(gè)單參數(shù)直方圖。臨床實(shí)踐中常以多個(gè)散點(diǎn)圖聯(lián)合分析。二、雙參數(shù)直方圖

X軸反映SSC的信號(hào)強(qiáng)弱Y軸反映FSC的信號(hào)強(qiáng)弱

X軸反映FITC熒光信號(hào)強(qiáng)弱Y軸反映PE熒光信號(hào)強(qiáng)弱

點(diǎn)圖把代表相同細(xì)胞數(shù)目的點(diǎn)依次連接起來形成密閉曲線，越在里面的曲線代表的細(xì)胞數(shù)目越多，越密集的區(qū)域也就是細(xì)胞數(shù)目變化最快的區(qū)間。二維等高圖三維坐標(biāo)均為參數(shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞亞群觀察更為直觀、準(zhǔn)確，但對(duì)其數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析較難三、三參數(shù)直方圖FCM常常需要分析三個(gè)以上的參數(shù)，但軟件技術(shù)能夠無法顯示四維空間結(jié)構(gòu)。隨著FCM多色熒光信號(hào)檢測(cè)的發(fā)展，所得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)需根據(jù)需要進(jìn)行組合分析以獲得所需的信息。多參數(shù)分析能夠同時(shí)比較各種細(xì)胞的不同抗原表達(dá)水平，可以統(tǒng)計(jì)出多種數(shù)據(jù)。四、多參數(shù)組合分析

指同一張單參數(shù)或雙參數(shù)直方圖中根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱來劃定分析區(qū)域，從而計(jì)算分析區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。Region設(shè)置2Gate設(shè)置

1指在某一張選定參數(shù)的直方圖上根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本的所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)該群細(xì)胞的分布情況。Region設(shè)置

Gate設(shè)置

淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的一群重要細(xì)胞群，是執(zhí)行免疫功能和參與免疫調(diào)節(jié)的免疫活性細(xì)胞，主要分為T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞3大類。不同淋巴細(xì)胞表達(dá)的CD抗原都有獨(dú)自的抗原特性，在臨床疾病發(fā)生過程中對(duì)各淋巴細(xì)胞的CD抗原進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)、了解免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有十分重要的意義。第四節(jié)FCM的臨床應(yīng)用

一、淋巴細(xì)胞亞群分析采用三色標(biāo)記的單克隆熒光抗體，可對(duì)T細(xì)胞亞群進(jìn)行分類。Th細(xì)胞表達(dá)CD3+CD4+CD8-Tc細(xì)胞表達(dá)CD3+CD4-CD8+

（一）T淋巴細(xì)胞及亞群分析

外周血中成熟B細(xì)胞特有的標(biāo)志是BCR。成熟B細(xì)胞主要表達(dá)CD19、CD20、CD21、CD22分子，同時(shí)檢測(cè)CD5分子，可進(jìn)一步將B細(xì)胞分為B1和B2細(xì)胞，正常人外周血細(xì)胞以B2為主。（二）B淋巴細(xì)胞及亞群分析

（三）NK細(xì)胞分析

自然殺傷細(xì)胞主要的表面標(biāo)志包括CD16、CD56。目前臨床上常采用三色熒光抗體標(biāo)記將CD3-CDl6+CD56+淋巴細(xì)胞定為自然殺傷細(xì)胞。白血病免疫表型分析是利用單克隆抗體檢測(cè)白血病細(xì)胞表面和胞漿內(nèi)的抗原，通過分析其表型以了解白血病細(xì)胞的分類和分期，是研究白血病分化抗原和白血病分類診斷的重要手段。白血病細(xì)胞可用造血細(xì)胞分化抗原來標(biāo)記檢測(cè)。可檢測(cè)出具有異常表型的淋巴細(xì)胞，由此可用于對(duì)各型白血病的鑒別診斷二、白血病免疫表型分析

FAB分類CD13CD33CD11bCD14HLA-DRCD34CD117MPOM0++/---++++M1++-/+-++++M2++--++/-++M3++----++M4+++++/-+/-++M5a+++/-+/-+/-+-/+M5b++++++-/+M6+/-+/-+/--+/--+M7-+/---++?-典型AML的免疫表型特點(diǎn)三、免疫血液病中的應(yīng)用PNH是一種以補(bǔ)體介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血為特征的獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病。PNH患者其紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面的CD55、CD59抗原明顯減少或消失。臨床上常常通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血細(xì)胞上CD55和CD59的表達(dá)，作為PNH的診斷和療效的評(píng)估依據(jù)。1.PNH診斷

FCM是當(dāng)前血小板研究中不可缺少的檢測(cè)工具，可用于檢測(cè)血小板的多項(xiàng)指標(biāo)。對(duì)血小板相關(guān)的多種疾病診斷、治療和預(yù)防，以及抗血小板活化