酶免疫技術-酶免疫技術的概述（免疫學檢驗課件）

酶免疫技術酶免疫技術：以酶標記的抗體或抗原作為主要試劑，將抗原抗體反應的特異性和酶催化底物反應的高效性和專一性相結合的一種免疫檢測技術。酶標記抗體(抗原)抗體(抗原)的免疫學活性酶對底物的催化活性酶底物顯色定性、定位、定量基本原理

酶免疫分析技術的原理是利用酶標記抗體(抗原)形成酶標抗體(抗原)結合物，此結合物既保留抗體(抗原)的免疫活性，又保留了酶對底物的催化活性。酶標抗體(抗原)與相應抗原(抗體)進行反應后，酶催化相應的底物顯色，借助酶作用于底物的顯色反應來判定結果。YEYE抗原酶標抗體底物酶免疫技術的分類克隆酶供體免疫測定酶免疫技術酶免疫組織化學技術酶免疫測定技術均相酶免疫測定非均相酶免疫測定酶放大免疫測定技術液相酶免疫測定固相酶免疫測定(ELISA)一、常用的酶及底物

（一）標記酶的條件：

①活性高，純度高②作用專一性強③性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)④測定方法簡便易行、敏感、精確⑤酶和底物對人體無害⑥酶和底物價廉易得酶免疫技術的概述1.辣根過氧化物酶(HRP)

糖蛋白(主酶)+亞鐵血紅素(輔基)

酶質(zhì)量純度(RZ)=A403nm/A275nmRZ>3.0活性:在25度條件下1分鐘將1微克底物轉化為產(chǎn)物的酶量為1個單位RZ值與酶活性無關，酶活性單位比RZ值更為重要（二）常用的酶和底物鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA

2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物在ELISA中HRP的底物為過氧化物和供氫體（DH2），目前常用的過氧化物是過氧化氫，H2O2十DH2—D十2H20OPD（鄰苯二胺

）反應后顯橙黃色，加酸終止反應后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，有致癌性。TMB（四甲基聯(lián)苯胺

）反應后顯藍色，加酸終止反應后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應用最廣泛的底物。是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌提取

AP的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

2.堿性磷酸酶(ALP)源于大腸埃希菌，常用于均相酶免疫測定。β-Gal的底物4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量。3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）

在商品試劑中，經(jīng)常應用的酶還有葡萄糖氧化酶(GOD)

、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、蘋果酸脫氫酶等。4.其他酶二、制備酶標記抗體(抗原)的方法制備要求：抗原要求純度高、抗原性強?？贵w則要求特異性強、效價高、親和力強、易于分離純化和批量生產(chǎn)。（一)戊二醛交聯(lián)法

戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與酶和抗體（抗原）分子上的氨基結合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質(zhì)量較均一。（二)改良過碘酸鈉法

僅用于HRP的標記?？膳c抗體蛋白的游離氨基結合，形成HRP-CH2-NH-IgG。有人認為是最好的方法，也有人認為試劑過于強烈，實驗重復性不夠好。三、酶標記物的純化與鑒定

1．酶標記物的純化

標記完成后應除去反應溶液中的游離酶、游離抗體(抗原)、酶聚合物及抗體(抗原)聚合物，避免游離酶增加非特異顯色以及游離抗體(抗原)的競爭作用。

常用的純化方法有葡聚糖凝膠層析法和飽和硫酸銨沉淀法等。

2.酶標記物的鑒定（1）酶活性及免疫活性鑒定：常用免疫電泳或雙向免疫擴散法，出現(xiàn)沉淀線表示結合物中的抗體(抗原)具有免疫活性。沉淀線經(jīng)漂洗后加底物能顯色，表示標記物中的酶仍具有活性。（2）酶標記率測定：用分光光度法分別測定結合物中酶和抗體(抗原)蛋白的含量，然后按公式計算其標記率。四、固相載體

（一）固相載體的要求①可結合抗原或抗體及親和素或鏈霉親和素等大分子；②結合抗體(抗原)的容量大，結合穩(wěn)定；③固相化后分子仍應保持活性；④固相化方法應簡便、快速。（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應板、小試管和小珠三種。2．微顆粒微顆粒是由聚苯乙烯高分子單體聚合成的微球或