葡聚糖凝膠過(guò)濾法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量

實(shí)驗(yàn)二十葡聚糖凝膠過(guò)濾法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量目的要求學(xué)習(xí)用葡聚糖凝膠過(guò)濾法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。實(shí)驗(yàn)原理葡聚糖凝膠（Sephadex）過(guò)濾法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理，主要是依據(jù)這種凝膠具有分子篩作用，一定型號(hào)的凝膠具有大體上一定大小的孔徑。在一定的凝膠柱內(nèi)，凝膠孔隙所占的體積成為內(nèi)水體積匕，凝膠顆粒間的自由空間所占的體積稱(chēng)為外水體積V0。當(dāng)樣品流經(jīng)凝膠柱時(shí)，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝膠內(nèi)部，只需V0體積的洗脫液便可將其由一端洗脫到另一端；相反，如果樣品體積小于孔隙，則需要vo+vi體積的洗脫液，才能將它們由一端洗脫到另一端。中等分子（分子大小在上述兩種極限之間）所需洗脫液體積介于兩者之間，Ve=V0+KdVi（0<Kd<1）。K為分配系數(shù)，它表示一種物質(zhì)在孔隙內(nèi)的滲透程度，相當(dāng)于這種物質(zhì)在孔隙內(nèi)所占d體積和孔隙總體積的比值。K=二dVi如果假定蛋白質(zhì)分子近于球形，同時(shí)沒(méi)有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質(zhì)，進(jìn)入凝膠篩孔的程度不同，其洗脫體積決定于分子大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在10000?15000時(shí)，蛋白質(zhì)在葡聚糖凝膠柱上層析的洗脫體積和分子量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系。若用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在一定型號(hào)葡聚糖凝膠柱上層析，精確測(cè)其洗脫體積，并以洗脫體積Ve對(duì)分子量的對(duì)數(shù)logMw作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下層析，根據(jù)其洗脫體積即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。三個(gè)不同大小分子組份上柱洗脫曲線示意圖本方法測(cè)分子量設(shè)備簡(jiǎn)單，結(jié)果處理方便，因此應(yīng)用較廣泛。但本方法僅適用于軸比相近似為球狀蛋白，對(duì)軸比大的纖維蛋白不適用；對(duì)含量大于5%的糖蛋白因有較大水合作用，測(cè)得分子量偏高；對(duì)含鐵蛋白測(cè)定數(shù)據(jù)偏低。——L.f-1—虹A''LL■!I—_上——L.f-1—虹A''LL■!I—_上_[—L」』]■I冼02xl(PIV4 IG*分于凡2000806040200080602211111Gf禳)(捋，￡>弄陵底擋想)?u(#禳二OOTOOJSS誨#.'Ve對(duì)logMW作圖由于Ve與柱的大小有關(guān)，如果用Ve/V0對(duì)logMw作圖，同樣可得一線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且可消除柱的大小和吸附效應(yīng)的誤差。1.細(xì)胞色素c2.核糖核酸酶3.肌紅蛋白4.a一胰凝乳蛋白酶5.胰蛋白酶6,胃蛋白酶7,過(guò)氧化物酶8,卵清蛋白9.血清白蛋白10.鐵蛋白Ve/V0對(duì)logMW作圖試劑和器材一、 試劑洗脫液：0.05MTris-HCl緩沖液，pH7.5,0.1MKCl溶液：稱(chēng)取12.12gTris,15gKCl,先用少量無(wú)離子水溶解，再加入6.67ml濃HCl，水定容至2L。藍(lán)色葡聚糖2000；SephsdexG-100；N-乙酰酪氨酸乙酯飽和溶液（以洗脫液飽和）。二、 材料牛血清白蛋白；卵清蛋白；細(xì)胞色素c；核糖核酸酶；三、 儀器層析柱；紫外檢測(cè)儀；自動(dòng)分部收集器。操作方法一、 溶脹凝膠取SephadexG-10015g，加500ml蒸餾水室溫溶脹三天（或沸水浴中溶脹5小時(shí)）。待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細(xì)顆粒，然后再放些蒸餾水?dāng)噥y，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液，至無(wú)細(xì)顆粒為止。溶脹平衡和漂洗凈的凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。二、 裝柱取2.6X60cm層析柱一根，底部用玻璃纖維或砂蕊濾板襯托，并要求濾板下的體積盡可能?。ǚ駝t被分離的組份間重新混合的可能性就大，其結(jié)果影響層析的靈敏度，降低分離效果）。在砂蕊濾板上覆蓋一張大小與柱的內(nèi)徑相當(dāng)?shù)目焖贋V紙片。將柱垂直至于鐵架上，然后在柱頂通過(guò)橡皮塞連接一長(zhǎng)頸漏斗（漏斗頸直徑約為柱直徑的一半）。在柱中加水或洗脫液，并趕凈濾板下方氣泡，使支持濾板底部完全充滿(mǎn)液體，然后將柱的出口關(guān)閉。把已經(jīng)溶脹好的凝膠調(diào)成薄漿，從漏斗倒入柱內(nèi)，膠粒逐漸擴(kuò)散下沉，薄漿連續(xù)加入。當(dāng)沉積的膠床至2?3cm高時(shí)，打開(kāi)柱的出口，并注意控制操作壓以均勻不變的流速直到膠裝完為止。柱裝好后，在床的上面蓋上一張大小略小與柱內(nèi)徑的濾紙片，以防止樣品中一些不溶物質(zhì)混入床中。再以洗脫液平衡柱層，直至層析的膠床高不變?yōu)橹?。柱裝得是否均勻，可用藍(lán)色葡聚糖上柱檢驗(yàn)；如果色帶均勻下移，說(shuō)明柱子已裝好，可以使用。層析柱的流速可借操作壓即進(jìn)出口液面的高度差來(lái)控制。凝膠床受操作壓的影響極為明顯。增加操作壓雖能增加流速，但時(shí)間長(zhǎng)久后，凝膠被壓緊反而使流速減慢。各類(lèi)凝膠能耐受的最大壓力如下表所示：型號(hào)壓力極限（毫米汞柱）G-20010G-18035G-7550G-50?G-10>100三、上樣稱(chēng)取0.5mg藍(lán)色葡聚糖2000（分子量200萬(wàn)以上）四份，分別放在稱(chēng)量瓶中，再稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白（分子量68000），卵清蛋白（分子量43000），核糖核酸酶（分子量13700），細(xì)胞色素c（分子量11700）各10mg，分別放在各稱(chēng)量瓶中；各瓶加入^乙酰酪氨酸乙酯飽和溶液0.5ml，使混合物溶解后分別上柱。樣品上柱是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，影響層析效果。上樣時(shí)應(yīng)盡量保持床面的穩(wěn)定。先打開(kāi)柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1?2mm時(shí)，關(guān)閉出口，用滴管將樣品慢慢地加至柱床表面，打開(kāi)出口并開(kāi)始計(jì)算流出體積，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面1mm時(shí)關(guān)閉出口，同時(shí)加樣品時(shí)一樣小心地加入少量洗脫液，再打開(kāi)柱的出口，使床表面的樣品也全部滲入柱內(nèi)。這時(shí)樣品已加好，在床的表面再小心地加洗脫液，使高出床表面3?5cm，接上恒壓洗脫瓶，調(diào)節(jié)操作壓在30cmH2O以?xún)?nèi)。四、收集和鑒定層析開(kāi)始，在柱的出口處以試管分管收集流出液（開(kāi)始時(shí)可用量筒，至80ml以后開(kāi)始4ml/＜分管收集），收集液在751分光光度計(jì)280nm處測(cè)OD值。最高的一個(gè)OD值時(shí)的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。當(dāng)N-乙酰酪氨酸乙酯洗脫峰出現(xiàn)后（此峰洗脫體積不必記錄）；按同樣的方法進(jìn)行第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的上柱，操作方法和步驟同前。將各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測(cè)得的洗脫體積Ve對(duì)它們的分子量對(duì)數(shù)作圖，則應(yīng)獲得一線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6注意事項(xiàng)（1） 根據(jù)層析柱的容積和所選用的凝膠溶脹后住床容積，計(jì)算所需凝膠干粉的重量，以將用作洗脫劑的溶液使其充分溶脹。（2） 層析柱粗細(xì)必須均勻，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)長(zhǎng)的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時(shí)分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時(shí)，會(huì)發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱管中心部分的組份移動(dòng)慢，而管壁周?chē)囊苿?dòng)快。柱越長(zhǎng)，分離效果越好，但柱過(guò)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。對(duì)于脫鹽的柱一般都是短而粗，柱長(zhǎng)（L）/直徑（。）10；對(duì)分級(jí)分離用的柱，L/D值可以比較大，對(duì)很難分離的組份可以達(dá)到L/D=100，一般選用內(nèi)徑為1cm，柱長(zhǎng)100cm就夠了。（3） 各接頭不漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏