糖尿病大鼠皮膚損傷模型的構(gòu)建

糖尿病大鼠皮膚損傷模型的構(gòu)建

皮膚修復(fù)材料作為一種新型的皮膚修復(fù)方法，具有良好的前景。糖尿病足等難愈性創(chuàng)面的皮膚修復(fù)對材料的性能和有效性有更高的要求，本研究采用STZ腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，并在其背部形成全層皮膚缺損創(chuàng)面，以構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚損傷模型，用于評價膠原蛋白膜、羧甲基殼聚糖止血海綿和明膠生物活性玻璃復(fù)合材料對難愈性皮膚損傷的修復(fù)作用，為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1檸不同酸鈉緩沖溶液的制備檸檬酸鈉緩沖溶液配制:2.10g檸檬酸加100mL雙蒸水配成檸檬酸母液;2.94g檸檬酸三鈉加100mL雙蒸水配成檸檬酸鈉母液;將檸檬酸母液和檸檬酸鈉母液按1∶1.32的比例混合，調(diào)節(jié)pH至4.0～4.5，得到所需的0.1mol/L的檸檬酸鈉緩沖溶液。STZ溶液配制:將STZ溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，配成濃度為10mg/mL的STZ溶液，用濾菌器過濾除菌后避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。膠原蛋白膜、羧甲基殼聚糖止血海綿(杭州英健生物科技有限公司)，明膠生物活性玻璃復(fù)合敷料(上海硅健生物材料有限公司)。1.2實驗動物SPF級雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量約200g(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心)。1.3實驗方法1.3.1皮膚多次注射SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后隨機分成5組，每組8只。禁食一晚，空腹血糖<6.1mmol/L的大鼠用于建立糖尿病大鼠模型。按照25mg/Kg、50mg/Kg、75mg/Kg和100mg/Kg的劑量腹腔注射STZ溶液，空白對照組注射檸檬酸鈉緩沖溶液。每天密切觀察所有試驗大鼠的一般情況。注射后第7、14、21和28天尾尖采血檢測非空腹血糖值。將15只SD糖尿病大鼠隨機分成3組，麻醉，備皮，于雙耳連線中間向下大約8cm處，以脊柱為中線分別切除1cm×1cm、2cm×2cm、3cm×3cm的正方形全層皮膚，深至肌層，用無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，醫(yī)用膠帶固定。術(shù)后動物單籠飼養(yǎng)，第0、5、12、21天觀察創(chuàng)面愈合情況。1.3.2感官評價方法將三種材料(膠原、羧甲基殼聚糖、明膠生物活性玻璃)剪至2cm×2cm大小。將80只SD糖尿病大鼠皮膚損傷模型隨機分為4組:空白對照組(n=20)、膠原組(n=20)、羧甲基殼聚糖組(n=20)、生物玻璃組(n=20)。膠原組、羧甲基殼聚糖組、生物玻璃組將相應(yīng)樣品直接敷在皮膚缺損創(chuàng)面，并用無菌敷料貼覆蓋;空白對照組直接用無菌敷料貼覆蓋創(chuàng)面。術(shù)后所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，每2天觀察實驗鼠的精神、活動和飲食變化，第3、7、14、21天打開敷料觀察創(chuàng)傷愈合與炎癥情況，拍照，作好觀察記錄，并在第14、21天取材進行病理切片檢查。1.4測試指標1.4.1傷口的一般恢復(fù)記錄造模后第3、7、14、21天大鼠創(chuàng)面滲出、黏連以及創(chuàng)口回縮等情況，大體判斷創(chuàng)面的恢復(fù)情況。1.4.2傷口愈合率造模后第3、7、14、21天對創(chuàng)面進行拍照(距離和曝光方式相同)，用圖像分析系統(tǒng)(ImagePro)測算創(chuàng)面愈合率。1.4.3皮膚組織病理學(xué)觀察造模后第14、21天，在創(chuàng)面上切取約1.0cm×1.0cm×0.5cm的皮膚組織，宜包含周圍正常皮膚組織，HE染色后觀察各時間點各組大鼠皮膚創(chuàng)面的修復(fù)情況和肉芽組織生長、炎癥反應(yīng)等。1.5統(tǒng)計分析以SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以2結(jié)果2.1動物非空腹血糖含量、成模率及死亡情況注射STZ后，25mg/KgSTZ組非空腹血糖值未到達糖尿病血糖標準(高于16.7mmol/L)，動物精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤;50mg/KgSTZ組部分大鼠非空腹血糖值>16.7mmol/L，成模率為50%;75mg/KgSTZ組所有大鼠血糖值均>16.7mmol/L，動物精神狀態(tài)差，弓背捲體，動作緩慢，毛發(fā)無光澤，成模率100%;100mg/KgSTZ組動物注射STZ后2d內(nèi)死亡5只，4d內(nèi)全部死亡。因此，確定以75mg/KgSTZ單次腹腔注射構(gòu)建糖尿病大鼠模型(圖1)。2.2兩組患兒表皮覆蓋和手術(shù)結(jié)果情況比較1cm×1cm組、2cm×2cm組所有動物術(shù)后均活動正常，創(chuàng)面隨時間延長而逐漸愈合。術(shù)后第5天，兩組創(chuàng)面愈合程度無明顯區(qū)別;術(shù)后第12天，1cm×1cm組大部分創(chuàng)面已被表皮覆蓋，創(chuàng)面基本愈合，而2cm×2cm組仍有大部分創(chuàng)面未被表皮覆蓋;術(shù)后第21天，1cm×1cm組創(chuàng)面已完全愈合，創(chuàng)面附近毛發(fā)生長良好，2cm×2cm組創(chuàng)面縮小，表皮已覆蓋大部分創(chuàng)面，但仍有小部分未愈合。3cm×3cm組術(shù)后第1天動物死亡1只，術(shù)后第3天、第4天各死亡2只。因此，最終確定在大鼠背部構(gòu)建2cm×2cm的全層皮膚損傷創(chuàng)面(圖2)。2.3修復(fù)材料的三種有效性2.3.1材料組合的對比各組大鼠均未出現(xiàn)感染及死亡情況。術(shù)后第3天，空白對照組動物創(chuàng)面明顯紅腫、滲出，創(chuàng)面邊緣無收縮跡象;3種材料組的創(chuàng)面處均較干凈，無滲出，傷口邊緣皮膚開始向內(nèi)收縮。術(shù)后第7天，對照組仍有明顯滲出，傷口邊緣開始收縮;3種材料組傷口收縮明顯，創(chuàng)面均被肉芽組織填滿;術(shù)后第14天，對照組創(chuàng)面縮小，結(jié)痂;膠原組和生物玻璃組痂皮脫落，創(chuàng)面被新生的表皮覆蓋。術(shù)后第21天，空白對照組痂皮脫落，被新生表皮覆蓋;3個樣品組創(chuàng)面已基本愈合。2.3.2覆巖宮腔內(nèi)研磨法檢測創(chuàng)傷率造模后第3、7、14、21天對創(chuàng)面進行拍照(每只動物拍照距離和曝光方式相同)，用圖像分析系統(tǒng)(ImagePro)測算創(chuàng)面愈合率。結(jié)果顯示，術(shù)后第3、7、14和21天，膠原組和生物玻璃組的創(chuàng)面愈合率均高于空白對照組，且具有顯著性差異(P<0.01);而羧甲基殼聚糖組的創(chuàng)面愈合率只在第3天略高于對照組，其余三個時間點均低于空白對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖3)。2.3.3皮膚附屬器術(shù)后第14天，膠原組和明膠生物玻璃組表皮已基本覆蓋全部創(chuàng)面，且出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，有小血管增生，皮膚附屬器清晰可見;羧甲基殼聚糖組仍有部分創(chuàng)面未被表皮覆蓋，未形成層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，真皮層內(nèi)可見毛細血管的閉合、退化和消失，未見皮膚附屬器;空白對照組部分創(chuàng)面無表皮覆蓋，仍可見較多的新生血管和成纖維細胞，無皮膚附屬器;術(shù)后第21天，膠原組和明膠生物玻璃組可見完整的皮膚結(jié)構(gòu)，可見皮膚附屬器;羧甲基殼聚糖組雖然仍未見皮膚附屬器長出，但出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu);空白對照組大部分創(chuàng)面已被表皮覆蓋，出現(xiàn)完整的皮膚結(jié)構(gòu)，雖然無皮膚附屬器長出，但創(chuàng)面已基本愈合(圖4)。3糖尿病大鼠皮膚損傷模型的建立正常的創(chuàng)面愈合涉及一系列級聯(lián)事件，包括止血/炎癥期、增殖期和重塑期糖尿病是胰島素分泌不足或胰島素作用障礙導(dǎo)致的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。糖尿病患者有10%～25%的幾率并發(fā)糖尿病足鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)是一種能破壞胰島β細胞的抗生素，已被證明具有致糖尿病的特性在糖尿病大鼠背部分別進行不同大小的全層皮膚切除，以尋找皮膚損傷模型的最佳創(chuàng)面大小。結(jié)果顯示，2cm×2cm組術(shù)后修復(fù)較1cm×1cm組平緩，利于皮膚修復(fù)材料有效性的比較。至此，標準化糖尿病大鼠皮膚損傷模型正式建立，即單次腹腔注射75mg/kgSTZ溶液，并在背部構(gòu)建2cm×2