第4章-菌種保藏課件

第四章菌種保藏關海燕生命科學技術學院nghaiyan1@126.com目錄1.菌種的退化2.菌種的保藏3.菌種的復壯一菌種的退化（一）菌種退化現(xiàn)象

生產菌株生產性狀的劣化或遺傳研究菌株遺傳標記的丟失均稱為菌種退化。菌種退化涉及微生物的形態(tài)和生理等多方面的變化。例如產生孢子能力的喪失，發(fā)酵液中產物組成改變，主產物減少和副產物增加等。（二）菌種退化的原因

菌種退化的主要原因是有關基因的負突變。是不可避免的，而減緩速度則是可能的。變異速度與菌種所處的環(huán)境有密切的關系，不良環(huán)境條件能促進變異，頻繁或過多傳代也是造成衰退變異的重要原因。為菌種創(chuàng)造良好條件，減緩菌種衰退，這就是菌種保藏與復壯工作。（三）防止菌種退化的措施

1．控制傳代次數

2．創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件

3．利用不同類型的細胞進行移種傳代

4．采用有效的菌種保藏方法

（一）目的使菌種不生長不死亡不污染不降低或不喪失其優(yōu)良性以盡量延長使用時間二菌種保藏

菌種保藏主要是根據菌種的生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。

一種好的保藏方法，首先應能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時考慮該方法的經濟適用性。

（二）菌種保藏的原理

保藏的一般程序是先選取優(yōu)良的純菌種，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠體，然后創(chuàng)造其最有利于休眠的環(huán)境條件，降低菌種代謝活動的速度，以達到長期保存的目的。低溫干燥無氧缺營養(yǎng)不利

條件

其中低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一種簡單易行的方法。在作低溫保藏時，注意盡量不損傷細胞。

在緩慢冷凍時，胞外基質一般較快結冰而形成冰晶使基質濃度增高，造成細胞水分外滲而大量脫水，可能使細胞死亡。如快速降溫，胞內也很快形成冰晶，胞內外滲透壓基本平衡，同時胞內冰晶較小，對細胞及原生質膜的損傷也較小，菌株不易死亡，影響也較小。

1.斜面低溫保藏法

將菌株接種于合適斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于4℃冰箱保藏，每隔一定時間（細菌，1個月；放線菌，3個月；酵母菌，3-6個月；絲狀真菌，4個月）進行移接培養(yǎng)后再將新斜面繼續(xù)保藏。（三）菌種保藏的方法

這種保藏方法簡單，存活率高，易于推廣，經常使用的菌種可采用這種方法。其缺點是菌種仍有一定強度的代謝活動條件，保存時間不長，而且傳代多，因此菌種客易產生變異。2.液體石蠟封藏法

將生長好的新鮮斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上端1cm，使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內保藏即可。這種方法也比較簡便，且保藏時間一般可長達1年以上。適于保存部分霉菌、酵母菌、放線菌，但對細菌效果較差，對某些能同化烴類的微生物則不適用。

石蠟油管的轉接和搬運都很不方便。3.砂土管保藏法

將孢子懸浮液轉移至滅過菌的砂土管中，于真空干燥器內用真空泵抽干，再轉至有干燥劑的容器中，密封低溫保藏。本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于細菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對干燥敏感的無芽孢的細菌和酵母菌。此法保存期可達1年以上。

主要包括砂土制備和真空抽干兩步。

（1）砂土制備砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般為3:2或1:1，將黃砂和泥土分別洗凈，過篩，按比例混合后，裝入小試管內，裝料高度約為lcm左右，經間歇滅菌2-3次，滅菌后烘干，并作無菌檢查后備用。

（2）真空抽干將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無菌水（3-5ml）洗下孢子，制成懸浮液，再與砂土混合（0.2-0.3ml）?；旌虾蟮纳巴凉芊旁谑⒂形逖趸谆驘o水氯化鈣的干燥器中，用真空泵抽氣干燥后，放在干燥低溫環(huán)境下保存。

4.真空冷凍干燥法

原理：在低溫下迅速將細胞凍結以保持細胞結構的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異和死亡，因而能長期保存，一般為5~10年。

微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質作保護劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。

該法存活率高，變異率低，并能廣泛適用于細菌（有芽孢和無芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。其缺點是手續(xù)麻煩，操作復雜，要求嚴格，并需有一定設備條件。5.超低溫冰箱保藏法

由于現(xiàn)在超低溫冰箱的使用已較普及，所以菌種的超低溫保藏法在生產企業(yè)和研究機構已得到廣泛應用。該方法的要點是：將要保藏的菌種置于10%甘油或二甲基亞砜保護劑中，密封于試管或安瓿管內，然后將其放入超低溫冰箱中于-70℃下保藏。該法簡便易行，而且保藏效果較好。6.液氮超低溫保藏法

微生物在-130℃的低溫下，所有的新陳代謝活動暫時停止而生命延續(xù)，這種環(huán)境下可永久性保存微生物菌種。液氮的溫度可達-196℃，保存微生物菌種已獲得滿意的結果。

液氮超低溫保藏法簡便易行，關鍵是要有液氮存儲裝置。

該方法要點是：將要保存的菌種（菌液或長有菌體的瓊脂塊），置于10%甘油或二甲基亞砜保護劑中，密封于安瓿管內（安瓿管的玻璃要能承受很大溫差而不致破裂），先將菌液降至0℃，再以每分鐘降低1℃的速度，一直降至-35℃，然后將安瓿管放入液氮中（液相或氣相均可，前者-196℃，后者-150℃）。

保藏的菌種如需用時，將安瓿管由液氮中取出，立即置于38-40℃溫水浴中，振蕩，直到全部融化為止，開啟移種。液氮保藏法在實際應用中尚存在一些問題，如需要經常補充液氮，保藏菌種的管理費用高，菌種的取出也不如凍干管方便。但這種方法可用微生物的多種培養(yǎng)材料進行保藏，不論孢子或菌體、液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)、菌落或斜面均可。此法是目前最可靠的移種長期保存菌種的方法。

7.固體曲保藏法（麩皮保藏法）

適用于產孢子的真菌。該法采用麩皮、大米、小米或麥粒等天然農產品為產孢子培養(yǎng)基，使菌種產生大量的休眠體(孢子)后加以保存。

將要保存的菌種制成孢子懸浮液，取適量加入已滅菌的大米培養(yǎng)基中，敲散拌勻，鋪成斜面狀，在一定溫度下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中要注意翻動，待孢子成熟后，取出置冰箱保存，或抽真空至水分含量在10％以下，放在盛有干燥劑的密封容器中低溫或室溫保存。保存期1～3年。8.基因工程菌的保藏

基因工程菌由于它們的載體質粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩(wěn)定、且其外源質粒復制子很容易丟失。

另外，對于宿主細胞質粒基因通常為生長非必需，一般情況下當細胞丟失這些質粒時，生長速度會加快。而由質粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質粒的細胞群體時極為有用。

當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質粒復制與染色體復制的協(xié)調。

由此基因工程菌最好應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。

例如，質粒pBR322。它除了能將外源DNA輸入E.coli細胞外，還賦予E.coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp和Tet，則培養(yǎng)時可選擇出含pBR322質粒的細胞。幾種常用菌種保藏方法的比較方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固體）石蠟油封藏法沙土保藏法冷凍干燥法低溫低溫低溫、缺氧干燥、無營養(yǎng)干燥、無氧、低溫、有保護劑各大類細菌、酵母菌各大類產孢子微生物各大類3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上簡便簡便簡便簡便有效簡便有效

1.我國由于1979年7月成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM),它的任務是促進我國微生物菌種保藏的合作、協(xié)調與發(fā)展,以便更好地利用微生物資源為我國經濟建設、科學研究和教學服務。該委員會下設7個菌種保藏管理中心,其負責單位、代號及保藏菌種的性質各有不同。

（四）菌種保藏機構（1）中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC(歸口中國科學院)

中國科學院微生物研究所(AS)

中國科學院武漢病毒研究所(AS-IV)

（2）中國農業(yè)微生物菌種保藏中心ACCC(歸口中國農業(yè)科學院)

中國農業(yè)科學院土壤與肥料研究所(ISF)

（3）中國工業(yè)微生物菌種保藏中心CICC(歸口輕工業(yè)總會)

中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所(IFFI)

（4）中國醫(yī)學微生物菌種保藏中心CMCC(歸口衛(wèi)生部)

中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所(ID)，南京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所(NICPBP)

中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所

（5）中國抗生素微生物菌種保藏中心CACC(國家醫(yī)藥管理局)

中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所四川抗生素研究所(SIA)，四川華北制藥廠抗生素研究所(IANP),石家莊

（6）中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心CVCC(歸口農業(yè)部)

農業(yè)部獸藥監(jiān)察研究所(NCIVBP)

（7）中國林業(yè)微生物菌種保藏中心CFCC(歸口中國林業(yè)科學院)

中國林業(yè)科學院林業(yè)研究所(RIF)2.美國典型培養(yǎng)物收藏中心ATCC3.美國北部開發(fā)利用研究部NRRL4.荷蘭霉菌中心保藏所CBS5.英國國家典型菌種保藏所NCTC6.日本大阪發(fā)酵研究所IFO三、菌種復壯三菌種的復壯

使衰退的菌種恢復原來優(yōu)良性狀。狹義的復壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的措施；

廣義的復壯是指在菌種的生產性能未衰退前就有意識的經常、進行純種的分離和生產性能測定工作，以期菌種的生產性能逐步提高。實際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產中選種。

菌種的復壯措施(一)菌種的提純(二)通過寄主體進行復壯(三)淘汰已衰退的個體(四)遺傳育種法

(一)菌種的提純

即從已衰退的菌種中，通過分離純化，將尚未退化的個體分離出來，以恢復和建立具有原來生產性狀的群體，繼續(xù)供科研及生產使用。

菌種提純方法：

一是較為粗放的方法，只要求達到菌落純化的水平（從種的水平來說是純的），通過稀釋平板法、劃線法、表面涂血法等常規(guī)操作法，適用于菌退化不太嚴重的情況。

另一類方法為較精細的單細胞或單孢子分離方法。它可以達到“細胞純”即“菌株純”的水平。要達到“細胞純”的水平，除可采用單胞分離法，也可以二者結合（先用前一種方法獲得較純的菌種后再采用單胞分離法進一步純化）。此類方法應用較廣，種類很多，既有簡單的利用培養(yǎng)皿或凹玻片等作分離室的方法，也有利用復雜的顯微操縱器的純種分離方法。對于不長孢子的絲狀菌，則可用無菌小刀切取菌落邊緣的菌絲尖端進行分離移植，也可用無菌毛細管截取菌絲尖端單細胞進行純種分離。(二)通過寄主體進行復壯

對于寄生性的退化菌株,可回接到相應寄主體上,以恢復或提高其寄生性能。例如,根瘤菌屬經人工移接,結瘤固氮能力減退,將其回接到相應豆科寄主植物上,令其侵染結瘤,再從根瘤中分離出根