熒光顯微鏡課件

熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高。主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位以及化學(xué)成分等的研究。

熒光顯微鏡就其光路來(lái)分有兩種：

1．透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光的。這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱．2．落射式熒光顯微鏡：這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45度角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。熒光顯微鏡就其光路來(lái)分有兩種：

1．透射式熒光顯微鏡熒光顯微鏡的使用方法

1．打開(kāi)燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。

2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。

3．用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。

4．放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無(wú)熒光的特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開(kāi)，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。

5．觀察。熒光顯微鏡的使用方法

1．打開(kāi)燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱熒光顯微鏡在各領(lǐng)域的應(yīng)用

細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。熒光顯微鏡在各領(lǐng)域中的應(yīng)用都非常廣泛。熒光顯微鏡在各領(lǐng)域的應(yīng)用

(1)熒光顯微鏡的應(yīng)用包括一般熒光染色和免疫熒光染色方法,熒光染色方法可以顯示細(xì)胞內(nèi)的各種成份,特別是對(duì)細(xì)胞內(nèi)的兩種核酸(DNA或RNA)及酸性粘多糖有較強(qiáng)的特異性,所以熒光染色法可以作為一種良好的細(xì)胞化學(xué)方法。免疫熒光方法是把免疫學(xué)技術(shù)和熒光染色結(jié)合起來(lái)一種方法,它具有免疫學(xué)的特異性和熒光方法的敏感性,作為一種研究方法或?qū)嶒?yàn)手段,廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)各種基礎(chǔ)理論研究和臨床診斷,如組織細(xì)胞學(xué),微生物學(xué),寄生蟲(chóng)學(xué),病理學(xué)的研究以及自身免疫病診斷。

20世紀(jì)30年代熒光染色即已用于細(xì)菌、霉菌等微生物及細(xì)胞、纖維等的形態(tài)觀察和研究。如用抗酸菌熒光染色法可幫助人們?cè)谔抵姓业浇Y(jié)核桿菌。40年代創(chuàng)造了熒光染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的技術(shù),這種技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于免疫熒光抗體染色的常規(guī)技術(shù)中,可檢查和定位病毒、細(xì)菌、霉菌、原蟲(chóng)、寄生蟲(chóng)及動(dòng)物和人的組織抗原與抗體,可用以探討病因及發(fā)病機(jī)理,如腎小球疾病的分類及診斷,乳頭瘤病毒與子宮頸癌的關(guān)系等。

(2)熒光顯微鏡在植物研究中的應(yīng)用也非常廣泛。利用某些物質(zhì)在短光波照射下即可發(fā)生熒光的特性,對(duì)植物細(xì)胞用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察研究。如細(xì)胞內(nèi)大部分脂質(zhì)和蛋白質(zhì)經(jīng)照射均可發(fā)出淡藍(lán)色熒光,而葉綠體發(fā)出火紅色熒光。但大部分物質(zhì)仍需要用熒光染料(如吖啶橙、異硫氰酸熒光素等)染色后,在短光波照射下才能發(fā)出熒光。

采用熒光顯微鏡技術(shù),可以觀察桔?；ǚ酃茏曰ㄊ诜?、自株花授粉、異花授粉下花粉粒的萌發(fā)生長(zhǎng),以及柱頭內(nèi)外授粉花粉粒的萌發(fā)情況?，F(xiàn)在在植物細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究中對(duì)線粒體進(jìn)行染色后,用熒光顯微鏡能夠很清晰地觀察到活細(xì)胞核呈黃綠色熒光,胞質(zhì)呈紅色熒光;凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。利用熒光標(biāo)記技術(shù)顯示微管,可以在多種植物生殖細(xì)胞內(nèi)清楚地看到微管骨架的存在。在植物細(xì)胞的觀察研究中,通過(guò)染色可以更清晰地觀測(cè)到細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),熒光顯微鏡還可以直接(不做任何處理)觀察植物葉的氣孔器,而且能觀察到氣孔的變化情況,為熒光顯微鏡找到了一種新用途。采用熒光顯微鏡技術(shù),可以觀察桔?；ǚ酃茏曰ㄊ诜?、左圖是哥倫比亞大學(xué)的簡(jiǎn)·施莫蘭澤(JanSch-moranzer)，在經(jīng)過(guò)血清饑餓處理的成纖維細(xì)胞的受創(chuàng)細(xì)胞膜上，拍攝到的微管結(jié)構(gòu)圖(綠色)。從圖上看來(lái)，成纖維細(xì)胞的微管已經(jīng)表現(xiàn)出異常行為。微管的直徑約20nm，通常情況下，當(dāng)細(xì)胞膜上有裂口時(shí)，微管會(huì)向裂口處聚集，但圖中反映的情況卻不是這樣。在細(xì)胞分裂間期，杜克大學(xué)的U·塞爾達(dá)爾·圖盧(U.SerdarTulu)在138μm寬的視野中，拍攝到了染色體(藍(lán)色)周?chē)谛纬傻奈⒐?黃色，右圖)。左圖是哥倫比亞大學(xué)的簡(jiǎn)·施莫蘭澤(JanSch-moran(2)熒光顯微鏡在動(dòng)物研究方面的研究也非常廣泛。利用動(dòng)物蛋白質(zhì)對(duì)光的選擇吸收特性，科學(xué)家早已發(fā)明了用熒光顯微鏡觀測(cè)活體動(dòng)物內(nèi)部器官組織和活細(xì)胞的技術(shù)，但光在動(dòng)物內(nèi)部組織的聚焦性能太弱，使顯微鏡下的圖像變得非常模糊，因此這項(xiàng)技術(shù)一直局限于研究表層厚度不超過(guò)1毫米的活體。通過(guò)熒光顯微鏡技術(shù)，科學(xué)家還可以對(duì)生物分子進(jìn)行光學(xué)標(biāo)注，研究在納米尺度內(nèi)的分子圖像。研究人員利用這種方法可以減少熒光著色活體組織的背景干擾信號(hào)，未來(lái)不僅可以研究其它脊椎動(dòng)物的細(xì)胞功能，還可用于開(kāi)發(fā)直接針對(duì)動(dòng)物器官和組織的新藥。(2)熒光顯微鏡在動(dòng)物研究方面的研究也非常廣泛。利用動(dòng)熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗），用該標(biāo)記抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測(cè)該抗原的存在與分布。另外，根據(jù)熒光蛋白的特性，熒光顯微鏡還可用于轉(zhuǎn)基因方面的研究，是熒光觀察的有利工具。熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即應(yīng)用實(shí)例熒光顯微鏡在轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用根據(jù)轉(zhuǎn)座子piggybac（PB）在哺乳動(dòng)物中的轉(zhuǎn)座能力，而且攜帶著許多個(gè)基因的PB元素在人類和老鼠的細(xì)胞系中可以有效的轉(zhuǎn)置，PB允許它攜帶的標(biāo)記基因的表達(dá)。我們將帶有轉(zhuǎn)座子、標(biāo)記基因紅色熒光蛋白基因的供體質(zhì)粒pBac[DsRed]和帶有轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒helper通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入家蠅新產(chǎn)卵（1.0～1.5h內(nèi)）中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。應(yīng)用實(shí)例

方法

1.質(zhì)粒DNA的提取,方法略。2.基因電轉(zhuǎn)移a.采集產(chǎn)出后1.0～1.5h內(nèi)的新鮮家蠅卵，加入少量TE，使卵在載玻片上分散并計(jì)數(shù)。每100枚卵為一個(gè)單位，放入反應(yīng)杯內(nèi)，再加入95ulTE、pBac[DsRed]和helper質(zhì)粒各5ul（200ng/ul），按脈沖電壓1500v和脈沖時(shí)間5.4ms進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。將經(jīng)電轉(zhuǎn)移處理的卵取出，放入新鮮配置的幼蟲(chóng)飼料（麩皮加水）中，于25～27℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。b.將培養(yǎng)3～4天的幼蟲(chóng)在倒置熒光顯微鏡下觀察，凡眼部和神經(jīng)脊索呈現(xiàn)特異紅色熒光的為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性（為了防止幼蟲(chóng)的爬行而影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，可以先把家蠅幼蟲(chóng)放在冰上一段時(shí)間后再觀察