熒光顯微鏡課件

熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內的熒光物質發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高。主要用于細胞結構和功能、細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位以及化學成分等的研究。

熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：

1．透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光的。這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱．2．落射式熒光顯微鏡：這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45度角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強。熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：

1．透射式熒光顯微鏡熒光顯微鏡的使用方法

1．打開燈源，超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮點。

2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。

3．用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調節(jié)裝置，調整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。

4．放置標本片，調焦后即可觀察。使用中應注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標本時，必須用無熒光的特殊油鏡；高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。

5．觀察。熒光顯微鏡的使用方法

1．打開燈源，超高壓汞燈要預熱熒光顯微鏡在各領域的應用

細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。熒光顯微鏡在各領域中的應用都非常廣泛。熒光顯微鏡在各領域的應用

(1)熒光顯微鏡的應用包括一般熒光染色和免疫熒光染色方法,熒光染色方法可以顯示細胞內的各種成份,特別是對細胞內的兩種核酸(DNA或RNA)及酸性粘多糖有較強的特異性,所以熒光染色法可以作為一種良好的細胞化學方法。免疫熒光方法是把免疫學技術和熒光染色結合起來一種方法,它具有免疫學的特異性和熒光方法的敏感性,作為一種研究方法或實驗手段,廣泛地應用于醫(yī)學領域內各種基礎理論研究和臨床診斷,如組織細胞學,微生物學,寄生蟲學,病理學的研究以及自身免疫病診斷。

20世紀30年代熒光染色即已用于細菌、霉菌等微生物及細胞、纖維等的形態(tài)觀察和研究。如用抗酸菌熒光染色法可幫助人們在痰中找到結核桿菌。40年代創(chuàng)造了熒光染料標記蛋白質的技術,這種技術現(xiàn)已廣泛應用于免疫熒光抗體染色的常規(guī)技術中,可檢查和定位病毒、細菌、霉菌、原蟲、寄生蟲及動物和人的組織抗原與抗體,可用以探討病因及發(fā)病機理,如腎小球疾病的分類及診斷,乳頭瘤病毒與子宮頸癌的關系等。

(2)熒光顯微鏡在植物研究中的應用也非常廣泛。利用某些物質在短光波照射下即可發(fā)生熒光的特性,對植物細胞用熒光顯微鏡進行觀察研究。如細胞內大部分脂質和蛋白質經(jīng)照射均可發(fā)出淡藍色熒光,而葉綠體發(fā)出火紅色熒光。但大部分物質仍需要用熒光染料(如吖啶橙、異硫氰酸熒光素等)染色后,在短光波照射下才能發(fā)出熒光。

采用熒光顯微鏡技術,可以觀察桔?；ǚ酃茏曰ㄊ诜?、自株花授粉、異花授粉下花粉粒的萌發(fā)生長,以及柱頭內外授粉花粉粒的萌發(fā)情況?，F(xiàn)在在植物細胞凋亡機理的研究中對線粒體進行染色后,用熒光顯微鏡能夠很清晰地觀察到活細胞核呈黃綠色熒光,胞質呈紅色熒光;凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側,可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。利用熒光標記技術顯示微管,可以在多種植物生殖細胞內清楚地看到微管骨架的存在。在植物細胞的觀察研究中,通過染色可以更清晰地觀測到細胞的形態(tài)及結構。在實驗中發(fā)現(xiàn),熒光顯微鏡還可以直接(不做任何處理)觀察植物葉的氣孔器,而且能觀察到氣孔的變化情況,為熒光顯微鏡找到了一種新用途。采用熒光顯微鏡技術,可以觀察桔?；ǚ酃茏曰ㄊ诜?、左圖是哥倫比亞大學的簡·施莫蘭澤(JanSch-moranzer)，在經(jīng)過血清饑餓處理的成纖維細胞的受創(chuàng)細胞膜上，拍攝到的微管結構圖(綠色)。從圖上看來，成纖維細胞的微管已經(jīng)表現(xiàn)出異常行為。微管的直徑約20nm，通常情況下，當細胞膜上有裂口時，微管會向裂口處聚集，但圖中反映的情況卻不是這樣。在細胞分裂間期，杜克大學的U·塞爾達爾·圖盧(U.SerdarTulu)在138μm寬的視野中，拍攝到了染色體(藍色)周圍正在形成的微管(黃色，右圖)。左圖是哥倫比亞大學的簡·施莫蘭澤(JanSch-moran(2)熒光顯微鏡在動物研究方面的研究也非常廣泛。利用動物蛋白質對光的選擇吸收特性，科學家早已發(fā)明了用熒光顯微鏡觀測活體動物內部器官組織和活細胞的技術，但光在動物內部組織的聚焦性能太弱，使顯微鏡下的圖像變得非常模糊，因此這項技術一直局限于研究表層厚度不超過1毫米的活體。通過熒光顯微鏡技術，科學家還可以對生物分子進行光學標注，研究在納米尺度內的分子圖像。研究人員利用這種方法可以減少熒光著色活體組織的背景干擾信號，未來不僅可以研究其它脊椎動物的細胞功能，還可用于開發(fā)直接針對動物器官和組織的新藥。(2)熒光顯微鏡在動物研究方面的研究也非常廣泛。利用動熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細胞化學研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標記抗體（一抗或二抗），用該標記抗體直接或間接地與細胞內的相應抗原結合，以檢測該抗原的存在與分布。另外，根據(jù)熒光蛋白的特性，熒光顯微鏡還可用于轉基因方面的研究，是熒光觀察的有利工具。熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細胞化學研究，即應用實例熒光顯微鏡在轉基因方面的應用根據(jù)轉座子piggybac（PB）在哺乳動物中的轉座能力，而且攜帶著許多個基因的PB元素在人類和老鼠的細胞系中可以有效的轉置，PB允許它攜帶的標記基因的表達。我們將帶有轉座子、標記基因紅色熒光蛋白基因的供體質粒pBac[DsRed]和帶有轉座酶的輔助質粒helper通過電轉化的方法轉入家蠅新產(chǎn)卵（1.0～1.5h內）中進行實驗研究。應用實例

方法

1.質粒DNA的提取,方法略。2.基因電轉移a.采集產(chǎn)出后1.0～1.5h內的新鮮家蠅卵，加入少量TE，使卵在載玻片上分散并計數(shù)。每100枚卵為一個單位，放入反應杯內，再加入95ulTE、pBac[DsRed]和helper質粒各5ul（200ng/ul），按脈沖電壓1500v和脈沖時間5.4ms進行電轉移。將經(jīng)電轉移處理的卵取出，放入新鮮配置的幼蟲飼料（麩皮加水）中，于25～27℃條件下進行培養(yǎng)。b.將培養(yǎng)3～4天的幼蟲在倒置熒光顯微鏡下觀察，凡眼部和神經(jīng)脊索呈現(xiàn)特異紅色熒光的為轉基因陽性（為了防止幼蟲的爬行而影響實驗的進行，可以先把家蠅幼蟲放在冰上一段時間后再觀察