葫蘆茶的分離、評價和開發(fā)

葫蘆茶的分離、評價和開發(fā)

肝纖維是肝纖維異常積聚的病理過程。它不是一種獨(dú)立的疾病，而是許多慢性肝病的共同病理特征。葫蘆茶為豆科植物葫蘆茶[Tadehagitriquetrum(L.)Ohashi]的枝葉，是廣西常用壯藥，壯名“Gohuzluzcaz.”，主要分布于廣西、廣東、海南等地。該藥味苦、澀，性涼，具有清熱解毒、利濕退黃、消積殺蟲的功效，臨床上常用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、肺癰、黃疸肝炎、腸炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、小兒疳積等癥1材料表面1.1高速冷凍多元離心復(fù)合材料722S型可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TDL-5型臺式低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WH-1型微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器有限公司）；5810R型高速冷凍多用途離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；GelDoc2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、PAC-300型低壓電泳儀、9700型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀、HD-4N型核酸蛋白測定儀、Model450型自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；5200型全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；DY89-Ⅱ型勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。1.2試劑與試劑盒葫蘆茶苷對照品（純度：>98.0%）由本課題組從葫蘆茶[T.triquetrum(L.)Ohashi]枝葉中分離所得，臨用前用2%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液稀釋，制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的混懸液；秋水仙堿片（廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號：20181001，規(guī)格：0.5mg）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、羥脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號分別為20170801、20170601、20170801、20171221、20170601、20171022）；透明質(zhì)酸（HA）、白細(xì)胞介素6(IL-6）試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（批號分別為N20012900、AK0017FEB22012);FirstStrandcDNASynthesisKit（美國MBI公司，批號：00064478);2×PCRTaqMix（日本Takara公司，批號：9108）；兔抗小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2）抗體、兔抗小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1.3實(shí)驗(yàn)動物：中國廣西gSPF級健康昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（桂）2014-0003。實(shí)驗(yàn)室溫度為（20±2）℃，所有小鼠均自由進(jìn)食、飲水。2方法2.1對等效劑量的設(shè)定將昆明種小鼠60只隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組（陽性對照，0.2mg/kg，劑量設(shè)置參照人等效劑量換算而得）以及葫蘆茶苷低、中、高劑量組（3、6、12mg/kg，劑量設(shè)置參照本課題組前期研究結(jié)果），每組10只。所有小鼠禁食過夜后，正常組小鼠腹腔注射等體積橄欖油，其余各組小鼠均腹腔注射10%CCl2.2elisa檢測相關(guān)血清中相關(guān)免疫指標(biāo)末次給藥10h后，所有小鼠均摘取眼球取血，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）以自動酶標(biāo)儀檢測其血清中ALT、AST、HA、IL-6的含量。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。2.3肝組織蛋白的測定小鼠取血后立即脫頸處死，剖取肝臟，于肝臟右葉相同部位取肝組織約0.1g，置于含生理鹽水的勻漿器中，于冰浴中制備成10%肝勻漿。采用考馬斯亮藍(lán)法對肝組織蛋白進(jìn)行定量后，采用分光光度法以可見光分光光度計(jì)檢測其肝組織中Hyp、SOD、MDA、GSH-Px的含量。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。2.4rt-pcr擴(kuò)增取小鼠肝組織適量，采用Trizol法提取肝組織總RNA。取上述總RNA2μg，按FirstStrandcDNASynthesisKit說明書方法，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以上述cDNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）以PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20μL):cDNA模板2μL,10μmol/L的上、下游引物（序列見表1）各lμL,2×PCRTaqMix10μL，用無酶水補(bǔ)至20μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，適宜溫度（Col-Ⅰ：55℃；TIMP-1和TIMP-2:52℃）退火30s,72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2.0μL，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（電壓：110V，時間：15min），并置于凝膠成像分析系統(tǒng)上成像。采用Image-proPlusV7.0圖像分析，以目的基因和內(nèi)參β-actin條帶的光密度（OD）值比值來表示目的基因mRNA的表達(dá)水平。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。2.5sds-采用電泳分離法檢測ca-ldf蛋白表達(dá)采用Westernblotting法檢測。取小鼠肝組織適量，加入RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑）1mL，于4℃下裂解后，并于4℃下以12000r/min離心10min。取上清液，采用BCA法測定蛋白含量，隨后加入SDS蛋白上樣緩沖液適量，于95℃水浴中變性5min。取變性后的蛋白進(jìn)行SDS電泳分離（電壓：80V，時間：30min），電泳完成后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入相應(yīng)一抗（稀釋度均為1∶1000),4℃孵育過夜；用TBST溶液清洗5min×3次，加入二抗（MMP-2和TGF-β2.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以3結(jié)果3.1il-6含量與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、HA、IL-6的含量均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中上述指標(biāo)的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表2。3.2hyp、mda含量與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px含量均顯著降低，而Hyp、MDA含量均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px含量均顯著升高，而Hyp、MDA含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表3。3.3timp-2mrnna的表達(dá)水平與正常組比較，模型組小鼠肝組織中Col-Ⅰ、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中上述指標(biāo)的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表4。3.4肝組織中的bup-2和tgf-a與正常組比較，模型組小鼠肝組織中MMP-2、TGF-β4cclhip蛋白的氨基酸成分肝纖維化是肝硬化以及肝功能衰竭的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)階段，是影響慢性肝病進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)，因此肝纖維化的預(yù)防、治療乃至逆轉(zhuǎn)是阻止肝硬化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)CCl血清中ALT、AST含量是評價肝細(xì)胞受損的基本指標(biāo)，在CClHyp是膠原蛋白結(jié)構(gòu)中特有的氨基酸成分，在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中含量極低；當(dāng)肝纖維化發(fā)生時，膠原蛋白的含量明顯增加，且Hyp的含量與肝纖維化