苯酚法提取RNA課件

苯酚法提取RNA苯酚法提取酵母RNA小老師：呂留帥鄒建指導老師：肖靚苯酚法提取RNA基本原理

細胞內大部分RNA均與蛋白質結合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA時要把RNA與蛋白質分離并除去。將細胞置于含有十二烷基磺酸鈉（SDS）的緩沖液中，加等體積水飽和酚，通過劇烈振蕩，然后離心形成上層水相和下層酚相。核酸溶于水相，被苯酚變性的蛋白質或者溶于酚相，或者在兩相界面處形成凝膠層。苯酚法提取RNA

本實驗采用的0.15mol/L緩沖液系統(tǒng)可使大部分RNA-蛋白復合物解離，而DNA-蛋白復合物只有極少部分解離；用酚處理時DNA-蛋白復合物變性，在低溫條件下從水相中除去，這樣得到的RNA制品中混雜的DNA極少。用氯仿-異戊醇繼續(xù)處理RNA制品，可進一步除去其中少量的蛋白質。最后用乙醇使RNA從水溶液中沉淀出來。本法得到的RNA不僅純度高，而且多呈自然狀態(tài)，可供繼續(xù)研究之用?；驹肀椒臃ㄌ崛NA主要試劑：

（1）SDS-緩沖液：0.3％SDS，0.1mol/LNaCl，0.05mol/L乙酸鈉，用乙酸調到pH5.0。

SDSNaCl乙酸鈉苯酚法提取RNA主要試劑（2）飽和酚液：重蒸苯酚用SDS溶液飽和。苯酚法提取RNA主要試劑（3）氯仿-異戊醇液：24﹕1（V/V）。氯仿異戊醇液苯酚法提取RNA主要試劑：（4）含2％乙酸鉀的95％乙醇溶液。苯酚法提取RNA主要試劑：（5）無水乙醇（6）溶菌酶（B.R.（1mg/L）苯酚法提取RNA主要儀器：（1）臺式高速離心機（10000r/min）苯酚法提取RNA主要儀器：（2）Eppendorf管（50mL）苯酚法提取RNA主要儀器：紫外可見分光光度計苯酚法提取RNA主要儀器分析天平苯酚法提取RNA主要儀器真空干燥器苯酚法提取RNA主要儀器電子天平苯酚法提取RNA實驗步驟：1．粗提取RNA稱量干燥的Eppendorf管的質量,取活性干酵母在研缽中研碎，取1g加入Eppendorf管,加10mLSDS-緩沖液使成勻漿。再加溶菌酶1mL，混勻，室溫靜置10min，再加10ml飽和酚液，室溫下劇烈振蕩5min，置冰浴中分層。苯酚法提取RNA實驗步驟：2．分離RNA

在0～4℃低溫環(huán)境下，10000r/min離心10min。吸出上層清液，轉入新的Eppendorf管。3．提純RNA

加同上清液等體積氯仿-異戊醇，室溫下劇烈振蕩2.5min，然后10000r/min離心5min。吸出上層清液，轉入另一新Eppendorf管。苯酚法提取RNA實驗步驟：4．沉淀RNA

加2倍體積95％乙醇（含2％乙酸鉀），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min離心5min，棄上清液，苯酚法提取RNA實驗步驟：5．洗滌RNA

沉淀用少許無水乙醇洗一次，迅速離心各1min，保留沉淀。傾去乙醚后，減壓真空干燥，準確稱重，記錄。苯酚法提取RNA實驗步驟：6．RNA制品純度的測定及RNA提取率的計算

將干燥后RNA產(chǎn)品配制成濃度為10—50μg／ml的溶液，在紫外可見分光光度計上測定其260nm處的吸光度，按下式計算RNA制品純度及RNA提取率苯酚法提取RNA實驗步驟：RNA含量=

RNA提取率=100%

式中，A260為260nm處的吸光度；L為比色杯光徑（cm）；0.024為lml溶液含lμgRNA的吸光度苯酚法提取RNA注意事項：1、注意安全，試驗要用到的有機試劑有毒性，特別是重蒸酚。2、使用離心機時,對稱的兩只Eppendorf管的質量一定要相同，以保證重心在軸心上。苯酚法提取RNA注意事項：3、有些Eppendorf管，密封不緊，一定要注意防漏。還有的Eppendorf管底部有裂紋，在離心時要把要把有裂紋的一側放在內側