化學(xué)遺傳學(xué)方法市公開(kāi)課一等獎(jiǎng)?wù)n件省賽課獲獎(jiǎng)?wù)n件

第三節(jié)化學(xué)遺傳學(xué)辦法

二十年前，編碼蛋白發(fā)覺(jué)引發(fā)了細(xì)胞周期調(diào)整領(lǐng)域一場(chǎng)革命。它們作為主要信號(hào)傳導(dǎo)組分確實(shí)認(rèn)加速了在這個(gè)領(lǐng)域研究，為深入生物化學(xué)研究提供了必要起點(diǎn)。在近些年，生物活性小分子化合物已經(jīng)在細(xì)胞生物學(xué)中起到類(lèi)似作用，化學(xué)生物學(xué)這一新領(lǐng)域把那些致力于理解和模擬自然世界化學(xué)家和生物學(xué)家?guī)У揭黄稹?994，哈佛大學(xué)TimMitchison[1]專(zhuān)家在首期“Chemistv&Bio1ogy"《化學(xué)和生物學(xué)》上論述了化學(xué)遺傳學(xué)(chemicalgenetics)基本概念。他指出要摸索生命過(guò)程必須有干擾生命過(guò)程伎倆，然后才能理解其后果。隨后，哈佛大學(xué)stuartL.Schreiber專(zhuān)家和TimMitchison專(zhuān)家開(kāi)始利用小分子來(lái)系統(tǒng)地摸索細(xì)胞和蛋白質(zhì)生理功能。1/138化學(xué)遺傳學(xué)采取小分子活性化合物作為探針，以多種方式影響靶蛋白功能，摸索和控制細(xì)胞過(guò)程。從另一方面來(lái)說(shuō)，化學(xué)遺傳學(xué)研究所取得成果-小分子化合物及其生物學(xué)效應(yīng)，除了被用來(lái)揭示生命基本活動(dòng)規(guī)律外，還也許成為候選藥品。也就是說(shuō)化學(xué)遺傳學(xué)研究活動(dòng)不是單純基礎(chǔ)研究，而與應(yīng)用緊密相聯(lián)。因此很多大型制藥公司都非常關(guān)注化學(xué)遺傳學(xué)。例如，哈佛大學(xué)在成立一種以從事化學(xué)遺傳學(xué)為關(guān)鍵“化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所”時(shí)，著名默抑制藥公司（Merck）就成為了該所主要贊助者之一。能夠說(shuō)，化學(xué)遺傳學(xué)出現(xiàn)把傳統(tǒng)學(xué)術(shù)研究試驗(yàn)室引進(jìn)了藥品開(kāi)發(fā)戰(zhàn)場(chǎng)。2/138在“化學(xué)遺傳學(xué)”出現(xiàn)同步，又出現(xiàn)了“化學(xué)基因組學(xué)”概念。二者研究思緒、內(nèi)容基本相同，只不過(guò)化學(xué)基因組學(xué)在化學(xué)遺傳學(xué)及化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)上又向前一步，研究與人類(lèi)疾病密切有關(guān)基因生物功能?？紤]到本書(shū)中很少包括到基因組學(xué)內(nèi)容，因此，主要介紹化學(xué)遺傳學(xué)辦法?；瘜W(xué)遺傳學(xué)與傳統(tǒng)遺傳學(xué)在思緒上有相通之處，它還能夠分為正向化學(xué)遺傳(forwardchemicalgenetics)和反向化學(xué)遺傳(reversechemicalgenetics)。前者用動(dòng)物細(xì)胞、微生物以及它們裂解產(chǎn)物來(lái)尋找對(duì)生物過(guò)程產(chǎn)生影響小分子，并確定對(duì)應(yīng)蛋白靶；后者則是先高體現(xiàn)某種蛋白，尋找與蛋白結(jié)合或影響純蛋白功能小分子，再對(duì)找到小分子在體內(nèi)進(jìn)行對(duì)此蛋白功能影響試驗(yàn)。3/138一、化學(xué)遺傳學(xué)基本辦法根據(jù)人類(lèi)基因組草圖，基因體現(xiàn)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)數(shù)量在100，000到數(shù)百萬(wàn)個(gè)，其中大部分屬于目前還不清楚未知蛋白質(zhì)，而化學(xué)遺傳學(xué)通過(guò)使用小分子作為探針研究細(xì)胞內(nèi)或完整組織中蛋白質(zhì)功能，通過(guò)這些分子探針作用模型生物化學(xué)解釋?zhuān)兄玫接嘘P(guān)復(fù)雜細(xì)胞過(guò)程中蛋白質(zhì)功能新信息?；瘜W(xué)遺傳學(xué)第一種關(guān)鍵步驟是合成可供篩選小分子庫(kù)，第二個(gè)關(guān)鍵步驟是發(fā)展精確、高速和低成本化學(xué)庫(kù)篩選辦法，取得盡也許多機(jī)理和特異性信息，第三個(gè)關(guān)鍵步驟是確證篩選得到化合物構(gòu)造，并確認(rèn)蛋白標(biāo)靶以及優(yōu)化化合物蛋白親和性。4/1381，小分子化合物庫(kù)構(gòu)建-高通量合成和制備過(guò)去，生物活性小分子主要是從生物有機(jī)體中發(fā)覺(jué)，不過(guò)，很也許它被認(rèn)定活性是由于機(jī)體內(nèi)許多化合物協(xié)同作用造成，而不但僅取決于這一小分子。為了克服這一困難，需要構(gòu)建包括大量具有確定構(gòu)造小分子化合物庫(kù)。5/1382，生物活性檢測(cè)-高通量篩選

在過(guò)去，從萬(wàn)個(gè)化合物中篩選具有生物活性小分子化合物是比較啰嗦和困難，高通量篩選是指利用自動(dòng)化篩選系統(tǒng)在相對(duì)短時(shí)間內(nèi)，通過(guò)特定生物模型來(lái)對(duì)成千上萬(wàn)化合物進(jìn)行活性篩選。目前人們能夠盡也許采取自動(dòng)方式利用96、384或1536孔板進(jìn)行生物活性分子篩選（圖a）。在設(shè)計(jì)化學(xué)遺傳學(xué)適合篩選辦法過(guò)程中，首先要確定是采取哪種化學(xué)遺傳學(xué)辦法，即正向還是反向化學(xué)遺傳學(xué)辦法，方便選擇“純蛋白”、“細(xì)胞”或“胚胎”檢測(cè)方式(圖b)。篩選過(guò)程首先是確定生物活性靶點(diǎn)以及檢測(cè)活性辦法，然后再設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)用于高通量篩選平臺(tái)。為了確保高通量篩選成果有效性，所用檢測(cè)辦法必須敏捷，并且反復(fù)性好。6/1387/138高通量藥品篩選技術(shù)是將多種技術(shù)辦法有機(jī)結(jié)合而形成新技術(shù)體系，它以分子水平和細(xì)胞水平試驗(yàn)辦法為基礎(chǔ)，以微板形式作為試驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過(guò)程，以敏捷迅速檢測(cè)儀器采集試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)試驗(yàn)取得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，在同一時(shí)間內(nèi)對(duì)數(shù)以千、萬(wàn)計(jì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并以對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)支持整個(gè)技術(shù)體系正常運(yùn)轉(zhuǎn)。分子水平和細(xì)胞水平試驗(yàn)辦法(或稱(chēng)篩選模型)是實(shí)現(xiàn)高通量藥品篩選技術(shù)基礎(chǔ)。由于高通量藥品篩選要求同步處理大量樣品，試驗(yàn)體系必須微量化。這些微量化試驗(yàn)辦法有些是應(yīng)用傳統(tǒng)試驗(yàn)辦法加以改善建立，更多是根據(jù)新科學(xué)研究成果建立。高通量篩選技術(shù)8/138高通量藥品篩選檢測(cè)系統(tǒng)迅速、高敏捷度檢測(cè)技術(shù)是高通量藥品篩選關(guān)鍵技術(shù)之一。在高通量藥品篩選中，檢測(cè)系統(tǒng)一般采取液閃計(jì)數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)計(jì)數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。檢測(cè)儀器敏捷度不停提升，雖然對(duì)微量樣品檢測(cè)，也能夠得到較好檢測(cè)效果。常用高通量藥品篩選模型能夠根據(jù)其生物學(xué)特點(diǎn)分為下列幾類(lèi)：①受體結(jié)合分析法。②酶活性測(cè)定法。③細(xì)胞因子測(cè)定法。④細(xì)胞活性測(cè)定法。⑤代謝物質(zhì)測(cè)定法。⑥基因產(chǎn)物測(cè)定法等等。9/1381、酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀是一種用途廣泛生物檢查醫(yī)療設(shè)備，利用酶聯(lián)免疫分析法，根據(jù)酶標(biāo)識(shí)原理，根據(jù)呈色物有、無(wú)和呈色深淺進(jìn)行定性或定量分析。這是一種極具生命力免疫學(xué)技術(shù)。可用于單克隆抗體篩分、凝血分、抗生素敏捷度檢查，以及其他需要進(jìn)行比色分析工作中。

10/138按照功能劃分，酶標(biāo)儀能夠分為光吸取酶標(biāo)儀，熒光酶標(biāo)儀，化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀和多功能酶標(biāo)儀。光吸取酶標(biāo)儀是用來(lái)進(jìn)行可見(jiàn)光與紫外光吸光度檢測(cè)。特定波長(zhǎng)光通過(guò)微孔板中樣品后，光能量被吸取，而被吸取光能量與樣品濃度呈一定百分比關(guān)系，由此能夠用來(lái)定性和定量檢測(cè)。光吸取檢測(cè)技術(shù)成熟，成本低，操作簡(jiǎn)單，不過(guò)動(dòng)態(tài)范圍窄，敏捷度比較低，特異性不強(qiáng)。一般可見(jiàn)光和紫外光分別采取鎢燈及氘燈作為光源，而紫外/可見(jiàn)酶標(biāo)儀是能夠?qū)煞N光源進(jìn)行切換，適應(yīng)不一樣測(cè)量波長(zhǎng)需求。11/138熒光酶標(biāo)儀是用來(lái)進(jìn)行熒光檢測(cè)，通過(guò)激發(fā)光柵分光后特定波長(zhǎng)光照射到被熒光物質(zhì)標(biāo)定樣品上后，會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)更長(zhǎng)發(fā)射光，通過(guò)發(fā)射光柵后達(dá)到檢測(cè)器。熒光強(qiáng)度與樣品濃度呈一定百分比。熒光檢測(cè)敏捷度高，可實(shí)時(shí)檢測(cè)，使用方便，檢測(cè)模式多樣，不過(guò)容易受外界干擾，激發(fā)光與發(fā)射光容易互相影響，干擾檢測(cè)。化學(xué)發(fā)光是來(lái)自生物化學(xué)反應(yīng)中自發(fā)光，可分為輝光型和閃光型兩種類(lèi)型。輝光型發(fā)光持久，穩(wěn)定，能連續(xù)一段時(shí)間；閃光型發(fā)光時(shí)間短，變化快，穩(wěn)定性不強(qiáng)，需要應(yīng)用自動(dòng)加樣器才能夠進(jìn)行?；瘜W(xué)發(fā)光中發(fā)出光子數(shù)與樣品量呈一定百分比關(guān)系，化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀敏捷度非常高，動(dòng)力學(xué)范圍廣。12/1382，多功能酶標(biāo)儀

多功能酶標(biāo)儀又稱(chēng)多功能微孔板檢測(cè)儀，可對(duì)以微孔板為體系試驗(yàn)提供多種不一樣模式檢測(cè)。一般，多功能酶標(biāo)儀最少可提供“吸取光”、“熒光”、“發(fā)光”三種不一樣檢測(cè)模式。某些中高端多功能酶標(biāo)儀還可完成“時(shí)間辨別熒光”、“熒光偏振”、“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”等高級(jí)熒光檢測(cè)試驗(yàn)。13/138多功能酶標(biāo)儀工作站Flexstation?3具有雙光柵提供1nm步徑全波長(zhǎng)檢測(cè)，可對(duì)6-384孔微孔板進(jìn)行光吸取(紫外-可見(jiàn))(200-1000nm)、熒光強(qiáng)度(250-850nm)、化學(xué)發(fā)光(250-850nm)、熒光偏振(400-750nm)和時(shí)間辨別熒光(250-850nm)五大功能檢測(cè)。

14/1383，高通量自動(dòng)篩選系統(tǒng)

高通量藥品篩選應(yīng)用試驗(yàn)辦法總體積一般要求在2～250

l，自動(dòng)化操作系統(tǒng)主要是指試驗(yàn)室自動(dòng)化工作站，俗稱(chēng)藥品篩選機(jī)器人，是由計(jì)算機(jī)控制全自動(dòng)試驗(yàn)室操作設(shè)備。試驗(yàn)室自動(dòng)化工作站基本功能是能夠自動(dòng)連續(xù)地完成試驗(yàn)基本操作，如加樣：即向每個(gè)反應(yīng)單位(微板中每一種孔)中加入多種不一樣成份、不一樣濃度、不一樣容積溶液；稀釋?zhuān)菏聦?shí)上就是加入一定容積樣品或試劑溶液后，再加入一定溶媒；轉(zhuǎn)移：主要是完成某一試劑或樣品位置變化；混合：將加入不一樣溶液進(jìn)行混合，混合方式有震蕩，也能夠用加樣器反復(fù)吹吸混合；15/138洗板：用合適溶液清洗試驗(yàn)用微板，或洗除不需要反應(yīng)液；溫孵：讓反應(yīng)體系在一定溫度條件下保持一定時(shí)間，使之完成反應(yīng)過(guò)程，自動(dòng)化工作站能夠嚴(yán)格控制溫孵溫度和時(shí)間；檢測(cè)：試驗(yàn)室自動(dòng)化工作站一般都能夠與某一種或多種檢測(cè)儀器連接，在試驗(yàn)操作完成后，能夠自動(dòng)進(jìn)行必要檢測(cè)并自動(dòng)采集儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，完成整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程。16/138目前，用于高通量藥品篩選儀器種類(lèi)很多，其最大特點(diǎn)是能夠?qū)Χ喾N不一樣規(guī)格微板中樣品直接進(jìn)行測(cè)定，猶如位素放射活性測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、生物發(fā)光測(cè)定、可見(jiàn)光比色、紫外光比色、熒光測(cè)定以及電化學(xué)測(cè)定等等。試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)是高通量篩選必備條件。由于高通量藥品篩選能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，對(duì)這些數(shù)據(jù)采集、儲(chǔ)存、分析、處理，必須依靠計(jì)算機(jī)完成。一般條件下，目前高通量藥品篩選使用檢測(cè)儀器，基本上都實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)采集自動(dòng)化，成果檢測(cè)完成，試驗(yàn)成果就自動(dòng)儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)中。17/138一般來(lái)說(shuō)，高通量篩選模型基本上可分為基于靶點(diǎn)篩選模型(target-basedassay)(亦稱(chēng)體外生化篩選模型)、細(xì)胞水平篩選模型(cellbasedassay)和胚胎水平篩選模型(embryo-basedassay)三類(lèi)。由于標(biāo)識(shí)技術(shù)發(fā)展(如顯色反應(yīng)、熒光、化學(xué)發(fā)光以及同位素標(biāo)識(shí)等)，對(duì)于細(xì)胞水平和胚胎水平篩選模型也能夠通過(guò)直接觀(guān)測(cè)表型來(lái)分析功能分子對(duì)生物過(guò)程影響。18/138（1）體外生化篩選模型

體外生化篩選模型主要是用來(lái)研究與生物體內(nèi)主要生理過(guò)程有關(guān)酶與底物、受體與拮抗劑或激動(dòng)劑、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間互相作用（見(jiàn)第二節(jié)互相作用與分子識(shí)別），能夠在體外通過(guò)蛋白結(jié)合能力或酶催化活性檢測(cè)方式完成，主要采取光學(xué)如發(fā)光、光吸取或熒光測(cè)定辦法。這些靶點(diǎn)往往和某個(gè)疾病過(guò)程有關(guān)。這是HTS中使用最多模型。根據(jù)生物分子類(lèi)型，分子水平藥品篩選模型主要分為受體、酶、通道、基因和其他類(lèi)型模型，其特點(diǎn)是藥品作用靶標(biāo)明確，應(yīng)用這些模型能夠直接得到藥品作用機(jī)理信息。19/138（2）細(xì)胞水平篩選模型

細(xì)胞水平篩選模型主要用于研究包括信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)整過(guò)程中有關(guān)靶點(diǎn)；由于該篩選體系與生物活性體系比較接近，因此被廣泛用于生物學(xué)和藥品研究中。細(xì)胞水平篩選也能夠根據(jù)研究方向不一樣選擇微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，二者各有利弊。微生物系統(tǒng)，如釀酒酵母和大腸桿菌，具有便宜迅速特點(diǎn)，不過(guò)細(xì)胞通透性不好，很多微生物還具有能將化合物有效泵出系統(tǒng)，篩選時(shí)化合物往往難以接近靶點(diǎn)，從而造成假陰性，錯(cuò)過(guò)某些本來(lái)具有不錯(cuò)活性小分子。哺乳動(dòng)物細(xì)胞通道性好，更接近真實(shí)活體環(huán)境，不過(guò)價(jià)格相對(duì)昂貴，也比不上微生物系統(tǒng)迅速。細(xì)胞水平篩選主要有細(xì)胞表型篩選、報(bào)告基因檢測(cè)、細(xì)胞印記以及細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞基礎(chǔ)生理測(cè)定和黑色素色素-易位測(cè)定等。20/138①細(xì)胞表型篩選具有一定遺傳型生物個(gè)體，在特定外界環(huán)境中，通過(guò)生長(zhǎng)和發(fā)育所體現(xiàn)出種種形態(tài)和生理特性總和，是生物體可見(jiàn)特性或特性，即為其表型（phenotype）。相同遺傳型生物，在不一樣外界條件下，會(huì)展現(xiàn)不一樣表型，但這不是真正變異，由于在這種個(gè)體中，其遺傳物質(zhì)構(gòu)造并未發(fā)生變化。顯微鏡檢測(cè)技術(shù)能夠檢測(cè)細(xì)胞表型變化，例如細(xì)胞形變、增生、凋亡以及紡錘體形態(tài)。該模型是觀(guān)測(cè)被篩樣品對(duì)細(xì)胞作用，但不能反應(yīng)藥品作用詳細(xì)途徑和靶標(biāo)，只能反應(yīng)出藥品對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程綜合作用，著眼于細(xì)胞整體某些功能，因此這種檢測(cè)辦法主要適合于初步篩選。21/138細(xì)胞外形上變化

22/138inhibitorsofSARS冠狀病毒-CoV

23/138細(xì)胞表型篩選需要通過(guò)多種顯微鏡觀(guān)測(cè)細(xì)胞整體形態(tài)變化、細(xì)胞器以及細(xì)胞骨架形態(tài)變化，這就需要用熒光染料分子對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)部組分進(jìn)行標(biāo)識(shí)。小分子熒光探針已經(jīng)稱(chēng)為化學(xué)生物學(xué)研究不可缺乏工具，如作為生物大分子標(biāo)識(shí)物、酶底物、環(huán)境批示劑以及細(xì)胞成像劑等。小分子熒光探針一般由兩部分組成：熒光團(tuán)以及與生物大分子（受體）專(zhuān)一性高親和力結(jié)合配體，通過(guò)受體與配體互相作用來(lái)標(biāo)識(shí)蛋白質(zhì)。小分子熒光探針應(yīng)當(dāng)能夠穿過(guò)細(xì)胞膜并且無(wú)毒；能夠與受體專(zhuān)一性穩(wěn)定結(jié)合，使得其在進(jìn)行監(jiān)測(cè)較長(zhǎng)時(shí)間(幾個(gè)小時(shí))內(nèi)保持穩(wěn)定性；背景噪音水平盡也許低；探針盡也許地設(shè)計(jì)成一定模式，使得多種熒光團(tuán)能夠方便地結(jié)合。選擇合適受體能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)位點(diǎn)專(zhuān)一性結(jié)合。24/138作為熒光標(biāo)識(shí)試劑，分子中具有比較活潑官能團(tuán)，這些基團(tuán)易與蛋白質(zhì)分子中NH2、OH、SH等共價(jià)結(jié)合，形成比較穩(wěn)定結(jié)合物?；钚曰鶊F(tuán)主要包括下列基團(tuán)：25/138對(duì)于受體選擇有下列兩個(gè)要求：(1)受體與目標(biāo)蛋白質(zhì)融合后必須能夠被基因體現(xiàn)；(2)受體應(yīng)當(dāng)盡也許小，以致不干擾目標(biāo)蛋白質(zhì)正常生理功能，因此較抱負(fù)受體是一段短序列肽鏈并且能夠插入目標(biāo)蛋白質(zhì)許多位點(diǎn)。一般說(shuō)來(lái)，受體與配體結(jié)合應(yīng)當(dāng)盡也許地快，有助于監(jiān)測(cè)時(shí)間敏感性生理過(guò)程。受體-配體作用一般包括半抗原-抗體?生物素-抗生物素蛋白、酶-底物、酶-抑制劑、蛋白質(zhì)專(zhuān)一性結(jié)合試劑等。26/138為了能夠在熒光顯微鏡下觀(guān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)部形態(tài)構(gòu)造，人們利用某些與細(xì)胞內(nèi)生物大分子專(zhuān)一性互相作用小分子化合物與不一樣類(lèi)型熒光染料偶聯(lián)，設(shè)計(jì)合成了一系列細(xì)胞探針。如核酸（或細(xì)胞核）探針（溴乙啶，吖啶橙、Hoechst33258、DAPI等）細(xì)胞骨架探針（紫三醇熒光探針、毒傘素?zé)晒馓结樀龋?、?xì)胞器探針（細(xì)胞器標(biāo)識(shí)酶底物探針）、細(xì)胞膜探針（磷脂、鞘磷脂、膽固醇熒光探針）以及某些特殊部位蛋白質(zhì)（與抗體偶聯(lián)或與專(zhuān)一性結(jié)合試劑偶聯(lián)）探針。熒光染料種類(lèi)很多，如熒光素類(lèi)、羅丹明類(lèi)、香豆素類(lèi)、二氟化硼-二吡咯甲烷（BODIPY)類(lèi)及乙錠類(lèi)化合物。

27/13828/138不一樣類(lèi)型熒光探針具有不一樣激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，從而在熒光顯微鏡下展現(xiàn)出不一樣顏色圖像，能夠容易地域分細(xì)胞各個(gè)不一樣部位形態(tài)變化。29/13830/13831/13832/13833/13834/13835/13836/13837/138②報(bào)告基因(reportergene)由于轉(zhuǎn)錄因子和基因體現(xiàn)有關(guān)因子是藥品作用主要靶標(biāo)，從而出現(xiàn)了報(bào)告基因法。假如把靶基因體現(xiàn)調(diào)控序列與編碼某種酶活性基因相連，轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)簡(jiǎn)單地檢測(cè)酶活性變化，就能夠反應(yīng)化合物對(duì)轉(zhuǎn)錄因子和基因體現(xiàn)作用性質(zhì)和程度，一般把這種能間接反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平編碼某種酶基因稱(chēng)為基因報(bào)告法。在應(yīng)用時(shí)，首先確定構(gòu)建模型所需調(diào)控序列，然后根據(jù)詳細(xì)情況選擇載體。應(yīng)用最普遍有熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因(β-Cal)和氯霉素已酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)。

38/138報(bào)告基因辦法39/138目前活體細(xì)胞應(yīng)用較多報(bào)告基因是綠色熒光蛋白(GFP)，因其適于活體細(xì)胞檢測(cè)，被稱(chēng)為生物傳感蛋白。它長(zhǎng)處是具有自發(fā)熒光，不需其他底物和輔因子且熒光穩(wěn)定，另外GFP與其他蛋白嵌合后不影響其本身熒光特性。GFP及其變體作為報(bào)告基因適用于實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究體內(nèi)或細(xì)胞水平蛋白定位和轉(zhuǎn)位，蛋白降解，蛋白-蛋白互相作用，細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞周期，并可檢測(cè)目標(biāo)基因體現(xiàn)變化。此類(lèi)報(bào)告基因體現(xiàn)能夠在多種組織和細(xì)胞中，采取不一樣光學(xué)檢測(cè)辦法通過(guò)對(duì)探針或化學(xué)發(fā)光底物光學(xué)信號(hào)檢測(cè)，來(lái)進(jìn)行靶標(biāo)功能研究。40/138③細(xì)胞印跡（Cytoblot）即高通量整體細(xì)胞免疫檢測(cè)（high-throughputwhole-cellimmunodetectionassay技術(shù)[38]，是在酶偶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）和免疫印跡（westernblotting）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)。該辦法用于迅速檢測(cè)小分子對(duì)DNA合成、蛋白質(zhì)翻譯后加工（乙酰化、磷酸化等）及細(xì)胞周期等影響，其基本原理與免疫印跡十分類(lèi)似。不過(guò)檢測(cè)某一類(lèi)細(xì)胞中分子是在多孔培養(yǎng)板上整體細(xì)胞水平進(jìn)行。41/138首先以待檢測(cè)分子作為抗原制備抗體，即一抗；然后選擇合適二抗進(jìn)行檢測(cè)，如采取連接有辣根過(guò)氧化物酶二抗與一抗偶聯(lián)，形成復(fù)合物通過(guò)加入氨基苯二酰一肼（luminol）、過(guò)氧化氫和對(duì)碘苯酚進(jìn)行檢測(cè)，若細(xì)胞中有待檢測(cè)分子（即抗原存在，則引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)使底片感光；假如不存在，則無(wú)發(fā)光反應(yīng)。其最大長(zhǎng)處是能夠進(jìn)行活性小分子高通量迅速篩選,能夠采取組織特異細(xì)胞在納升到毫升規(guī)模培養(yǎng)。但該辦法一般適合于初篩,要深入明確所得小分子活性還需結(jié)合其他篩選辦法。42/13843/138(3)胚胎水平篩選模型

此類(lèi)篩選比細(xì)胞水平篩選更接近活體環(huán)境，能夠看做是對(duì)藥品研發(fā)過(guò)程中動(dòng)物試驗(yàn)改善，比較常用是斑馬魚(yú)胚胎(zebrafishembryo)和果蠅胚胎(fruitflyembryo)等。由于傳統(tǒng)動(dòng)物試驗(yàn)所使用動(dòng)物體積相對(duì)較大，繁殖期也較長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)高通量篩選要求。44/13845/138斑馬魚(yú)斑馬魚(yú)(zebrafish)是一種熱帶硬骨魚(yú)，體積小(3-4cm)，可在較小空間大量繁殖，產(chǎn)卵量高(每周產(chǎn)卵可達(dá)200多個(gè))；發(fā)育快，許多組織在受精后二十四小時(shí)開(kāi)始形成，成熟周期短(3-4個(gè)月)；體外受精且胚胎透明，發(fā)育過(guò)程可在體視解剖鏡下觀(guān)測(cè)。斑馬魚(yú)這些特點(diǎn)使它適宜于作大規(guī)模突變篩選，是研究基因功能和脊椎動(dòng)物發(fā)育機(jī)制主要伎倆。46/138斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因在引發(fā)有關(guān)疾病時(shí)表型極為相同，可將斑馬魚(yú)作為研究人類(lèi)疾病主要模式生物體。因此，斑馬魚(yú)經(jīng)常用于進(jìn)行造血系統(tǒng)病理和生理功能研究。47/13848/13849/13850/13851/13852/138線(xiàn)蟲(chóng)為假體腔動(dòng)物，有超出28,000個(gè)已被統(tǒng)計(jì)物種，尚有大量種尚未命名。絕大多數(shù)體小呈圓柱形，又稱(chēng)圓蟲(chóng)（roundworms）。它們?cè)诘⒑Ｋ?、陸地上隨處可見(jiàn)，無(wú)論是個(gè)體數(shù)或物種數(shù)都往往超越其他動(dòng)物，并在極端環(huán)境如南極和海溝都可發(fā)覺(jué)。線(xiàn)蟲(chóng)屬兩側(cè)對(duì)稱(chēng)，體長(zhǎng)，一般兩端尖，并具透明隔腔（消化道與體壁間充滿(mǎn)液體體腔）。一般為雌雄異體，有些則為雌雄同體(即個(gè)體兼具雌雄生殖器官)。53/13854/138甘油醛-3-磷酸脫氫酶55/138酵母酵母是一種以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無(wú)性繁殖單細(xì)胞真核微生物,在我國(guó)已有4000數(shù)年應(yīng)用歷史。早期對(duì)酵母利用主要體目前釀造、食品和醫(yī)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域,利用酵母生產(chǎn)核苷酸、核黃素、細(xì)胞色素、維生素D2以及輔酶A等藥品曾為人類(lèi)健康事業(yè)發(fā)展做出過(guò)巨大奉獻(xiàn)。作為一種單細(xì)胞真核生物,酵母繁殖速度快、培養(yǎng)周期短、基因操作相對(duì)簡(jiǎn)單以及研究費(fèi)用相對(duì)低廉,使得其成為當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究中一種模式生物,釀酒酵母S1cerevisiae作為第一種完成全基因組序列分析真核生物,更是在生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。56/13857/13858/13859/138高內(nèi)涵篩選雖然目前已經(jīng)形成了可日篩選10萬(wàn)樣次超高通量篩選技術(shù)。不過(guò)，高通量藥品篩選技術(shù)單靶點(diǎn)單指標(biāo)篩選辦法，已經(jīng)不能適應(yīng)藥品發(fā)覺(jué)需要，并且也不利于對(duì)化合物活性綜合評(píng)價(jià)。在此情況下，以多指標(biāo)多靶點(diǎn)共同作用為主要特點(diǎn)高內(nèi)涵藥品篩選技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。60/138高內(nèi)涵藥品篩選模型主要建立在細(xì)胞水平或胚胎水平，通過(guò)觀(guān)測(cè)樣品對(duì)固定或動(dòng)態(tài)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能作用，包括靶點(diǎn)包括細(xì)胞膜受體、胞內(nèi)成份、細(xì)胞器等，從多種角度分析樣品作用，最后確定樣品活性和也許毒性。從篩選載體上看，高內(nèi)涵藥品篩選與高通量藥品篩選并沒(méi)有顯著區(qū)分，也在微孔板上進(jìn)行，目前使用較多仍然是96孔微板。高內(nèi)涵藥品篩選檢測(cè)體積并未因檢測(cè)指標(biāo)增加而增高，操作步驟同樣簡(jiǎn)單可行、自動(dòng)化。61/1383，靶點(diǎn)鑒別和確認(rèn)在第二節(jié)中我們論述了許多生物活性檢測(cè)技術(shù)用來(lái)確認(rèn)和表征小分子與蛋白質(zhì)之間互相作用。不過(guò)，在正向化學(xué)遺傳學(xué)中，小分子化合物庫(kù)通過(guò)細(xì)胞表型變化方式篩選，當(dāng)一種化合物被判定出后，就需要確定該化合物作用于哪種蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，這時(shí)要包括到多種不一樣檢測(cè)辦法。當(dāng)然，靶點(diǎn)也許不是蛋白質(zhì)，也許是細(xì)胞膜或核酸。而在反向化學(xué)遺傳學(xué)中，蛋白質(zhì)已經(jīng)事先選定，需要通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合能力篩選對(duì)與其結(jié)合小分子配體進(jìn)行檢測(cè)。采取靶點(diǎn)鑒別辦法，初篩出與小分子化合物結(jié)合蛋白質(zhì)，如親和層析、噬菌體展示、mRNA展示克隆、酵母三雜交、生化抑制等，然后再通過(guò)其他生物技術(shù)深入確認(rèn)，生物質(zhì)譜、免疫化學(xué)檢測(cè)、功能展示克隆等。這里介紹幾個(gè)靶點(diǎn)判定辦法。

62/138（1）小分子微陣列檢測(cè)借鑒DNA芯片技術(shù)，人們發(fā)展了一種稱(chēng)為小分子印跡（smallmoleculeprinting）技術(shù)，后來(lái)改稱(chēng)為小分子微陣列檢測(cè)技術(shù)（smallmoleculemicroarrays，SMM）來(lái)篩選靶蛋白小分子配體。小分子微陣列是一種新高通量判定蛋白質(zhì)結(jié)合小分子配體辦法，有時(shí)又稱(chēng)為化學(xué)芯片。小分子微陣列是一種具有1000-100000個(gè)探針部位對(duì)稱(chēng)排列整體平面，每個(gè)探針部位能夠具有通過(guò)共價(jià)或非專(zhuān)一性吸附固定化小分子化合物（如多肽、糖、類(lèi)藥品分子、天然產(chǎn)物等）。63/138首先，將應(yīng)用組合化學(xué)合成小分子分別溶解在合適溶劑中，采取高精度機(jī)器人將1nl具有每一種小分子樣品溶液精確定位點(diǎn)樣于一塊通過(guò)處理載片上，所有化合物都具有共同連接反應(yīng)官能團(tuán)，能夠通過(guò)共價(jià)鍵形式將小分子固定在載玻片上，從而形成高密度小分子陣列（1000個(gè)點(diǎn)/cm2）。用熒光標(biāo)識(shí)蛋白質(zhì)探出需要小分子配體，在載玻片洗滌除去非專(zhuān)一性吸附蛋白質(zhì)后，能夠通過(guò)掃描熒光斑點(diǎn)證明哪個(gè)小分子與蛋白質(zhì)發(fā)生了較強(qiáng)互相作用。在此基礎(chǔ)上，這些小分子能夠依次被多種標(biāo)識(shí)靶蛋白分別進(jìn)行篩選。該辦法選擇性好，敏捷度高。

64/138在小分子芯片（SMM）制備過(guò)程中，小分子固定是極其關(guān)鍵步驟，由于它決定了小分子以哪種方式與靶蛋白互相作用，也決定了在合成期間應(yīng)當(dāng)引入哪些化學(xué)基團(tuán)方便得到均勻固定化小分子。目前，有多種辦法用于構(gòu)建小分子芯片，如共價(jià)固定、光活化交聯(lián)和原位合成。65/13866/138共價(jià)固定：Puskas和他同事們用丙烯?；铜h(huán)氧化反應(yīng)建立了六種能夠共價(jià)固定化核酸、蛋白質(zhì)和小分子玻璃表面。他們使用樹(shù)枝狀化合物和三氨基連接體系增加了固定化效率。這種辦法可深入應(yīng)用于表面疏水性和親水性修飾，從而能夠產(chǎn)生多種變化表面有助于小分子芯片（SMM）應(yīng)用。Waldmann等使用溫和條件建立了一種在芯片上具有化學(xué)選擇性連接辦法，該辦法由有機(jī)磷衍生玻璃和帶有疊氮化分子組成。67/138光活化交聯(lián)：Mrksich等利用光活化后引發(fā)D-A反應(yīng)制備小分子芯片，首先他們將2-硝基-3,4-二甲氧基苯甲氧酰(NVOC)保護(hù)氫醌固定在金包衣玻璃表面，通過(guò)紫外照射，氫醌被活化，然后經(jīng)化學(xué)或電化學(xué)氧化形成對(duì)苯醌，再與環(huán)戊烯標(biāo)識(shí)配體反應(yīng)。68/138原位合成：這是一種不通過(guò)小分子固定化步驟，而是直接在芯片玻璃上連續(xù)合成形成小分子辦法。如Kodadek等使用MeNPOC-保護(hù)羥基乙酸和光活化偶聯(lián)等步驟制備小分子芯片。69/138（2）親合層析技術(shù)

親合層析技術(shù)是將小分子通過(guò)一種臂連接到固相介質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)萃取液通過(guò)親合層析柱，在某些情況下，靶蛋白被吸附在柱上。靶蛋白被洗脫下后，能夠通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行微量次序分析并根據(jù)遺傳密碼和遺傳信息轉(zhuǎn)譯成基因次序，這些辦法要求蛋白質(zhì)與小分子配體之間必須具有較強(qiáng)親和力，不然會(huì)存在問(wèn)題而不可靠。70/138將小分子配體（L）通過(guò)一種連接臂固定到固體載體上，然后與具有目標(biāo)靶蛋白（T）蛋白質(zhì)萃取液培育一定期間，通過(guò)一系列洗脫步驟除去未結(jié)合蛋白后，變化體系緩沖液條件（如離子強(qiáng)度、pH等）將所有結(jié)合在親和層析載體上蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，再用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳研究這些蛋白質(zhì)性質(zhì)。為了減少非專(zhuān)一性結(jié)合蛋白數(shù)量，能夠采取固定一種沒(méi)有活性小分子配體類(lèi)似物（A）同步進(jìn)行親和層析試驗(yàn)，電泳后進(jìn)行比較；同步采取在蛋白質(zhì)洗脫液中加入過(guò)量游離配體辦法，使目標(biāo)靶蛋白先于有游離配體結(jié)合，而非專(zhuān)一性蛋白與固定化配體結(jié)合，洗脫后經(jīng)電泳試驗(yàn)?zāi)軌蛏钊肱懦菍?zhuān)一性蛋白。也能夠采取系列層析技術(shù)，即在通過(guò)一次親和層析后，再將其洗脫液與新固定化配體培育，進(jìn)行第二次親和層析，洗脫后，通過(guò)電泳試驗(yàn)，并與第一次洗脫液電泳圖譜比較，最后確定小分子配體結(jié)合蛋白質(zhì)（圖中箭頭所指電泳條帶）。71/13872/13873/138（3）噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)編碼基因或目標(biāo)基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白構(gòu)造基因合適位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合體現(xiàn)，融合蛋白隨子代噬菌體重新組裝而展示在噬菌體表面。展示在噬菌體表面多肽或蛋白與固定化小分子配體通過(guò)一定期間孵育后，洗去未結(jié)合游離噬菌體，然后以競(jìng)爭(zhēng)受體或酸洗脫下與小分子配體結(jié)合吸附噬菌體，洗脫噬菌體感染微生物宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，通過(guò)3輪-5輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與小分子配體特異結(jié)合噬菌體得到高度富集，然后將該噬菌體表面展示多肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行判定，確定靶蛋白。

74/138噬菌體展示技術(shù)示意圖

75/138（4）酵母三雜交系統(tǒng)酵母三雜交系統(tǒng)(three-hybridsystem)是近幾年在酵母雙雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展由活性小分子判定靶蛋白辦法。其基本原理與酵母雙雜交類(lèi)似，只是在“鉤”與“魚(yú)”之間加了“餌”組成三雜交中3個(gè)組分:其中“餌”是一種修飾過(guò)活性小分子，是由活性小分子和配體A連接而成；“鉤”是由配體A受體蛋白與DB融合而成；“魚(yú)”是由cDNA庫(kù)中蛋白融合在AD上組成。當(dāng)待篩選靶組織cDNA庫(kù)中某一蛋白與小分子互相作用時(shí)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄被啟動(dòng)，這時(shí)細(xì)胞可通過(guò)報(bào)告基因檢測(cè)。76/13877/138三雜交系統(tǒng)78/13879/1384，化學(xué)遺傳學(xué)特點(diǎn)化學(xué)遺傳學(xué)看起來(lái)與傳統(tǒng)遺傳辦法類(lèi)似，化學(xué)遺傳學(xué)繼承了傳統(tǒng)遺傳學(xué)辦法高度特異性和方便實(shí)用性長(zhǎng)處，不過(guò)化學(xué)遺傳學(xué)與傳統(tǒng)遺傳學(xué)辦法相比，有其獨(dú)特優(yōu)越性。就像在遺傳審查中關(guān)鍵突變體分離同樣造成突變基因判定，小分子作用模式解釋能產(chǎn)生感愛(ài)好細(xì)胞靶部位判定。因此，化學(xué)遺傳學(xué)辦法具有下列特點(diǎn)：80/138①即時(shí)性化學(xué)遺傳學(xué)可進(jìn)行實(shí)時(shí)研究，采取傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法，無(wú)論是基因突變還是反義RNA或是RNAi等方法，調(diào)節(jié)蛋白水平都需要一段時(shí)間來(lái)完成，這對(duì)于研究細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程顯然不宜。而用小分子化合物調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能時(shí)，小分子則是直接對(duì)蛋白發(fā)生作用，因此具有高實(shí)時(shí)性，能夠在加入小分子之后幾分鐘到幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)立刻觀(guān)測(cè)到蛋白功能變化，這不但方便了研究，并且也大大加速了研究進(jìn)程。81/138②可逆性與傳統(tǒng)遺傳辦法（基因突變）相比，由于化學(xué)遺傳學(xué)所使用小分子化合物與體內(nèi)生物大分子作用經(jīng)常是可逆非共價(jià)互相作用，它只是臨時(shí)地抑制或激活了某種蛋白質(zhì)生物活性，使細(xì)胞整體功能發(fā)生了變化，在一定期間后，這些小分子化合物會(huì)被細(xì)胞內(nèi)酶催化代謝分解掉，因此，它們對(duì)細(xì)胞生物學(xué)影響是可逆。小分子作用就像是開(kāi)關(guān)同樣，當(dāng)加入小分子被代謝清除之后，蛋白功能又能夠恢復(fù)到正常狀態(tài)。而在遺傳學(xué)辦法中，基因敲除和過(guò)度體現(xiàn)一般是不可逆，具有永久性。82/138③可調(diào)性化學(xué)遺傳學(xué)是通過(guò)調(diào)整加入小分子濃度來(lái)逐層地觀(guān)測(cè)小分子對(duì)特定蛋白功能影響。能夠通過(guò)變化小分子濃度來(lái)影響它作用效果；而遺傳學(xué)辦法將基因直接敲除，因此該基因體現(xiàn)蛋白功能是完全喪失。例如，AnthoyC.Bishop等人通過(guò)在5-50000nmol/L范圍內(nèi)逐漸變化抑制劑濃度來(lái)研究其對(duì)激酶Cdc28功能影響。83/138④可操作性用化學(xué)遺傳學(xué)辦法進(jìn)行研究時(shí)，就能夠在細(xì)胞、胚胎等有機(jī)體發(fā)展到一種合適階段時(shí)，再加入小分子，從而來(lái)觀(guān)測(cè)和研究它對(duì)生物學(xué)功能影響。而有些對(duì)生命體很主要蛋白，敲除其基因往往是致命，甚至在還沒(méi)有觀(guān)測(cè)到感愛(ài)好表型之前，研究對(duì)象就已經(jīng)死亡，以致無(wú)法進(jìn)行下一步工作。另外，在化學(xué)遺傳學(xué)中，一種小分子化合物可用于研究一系列不一樣有機(jī)體中同一種過(guò)程，例如,布雷菲爾德菌素(brefeldin)Ａ可用于研究酵母、植物甚至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體運(yùn)輸過(guò)程，如用傳統(tǒng)遺傳學(xué)辦法，其工作量就相稱(chēng)大。一旦變化所要求試驗(yàn)對(duì)象，就要重新篩選新遺傳突變體。84/138雖然化學(xué)遺傳學(xué)/化學(xué)基因組學(xué)有很多長(zhǎng)處，不過(guò)以為化學(xué)遺傳學(xué)能夠替代遺傳學(xué)觀(guān)點(diǎn)卻是錯(cuò)誤。事實(shí)上，遺傳學(xué)某些特點(diǎn)是化學(xué)遺傳學(xué)所沒(méi)有，最典型就是遺傳學(xué)特異性。蛋白質(zhì)和基因是一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。理論上，任何蛋白都能找到和它相對(duì)應(yīng)基因。能夠通過(guò)對(duì)這段基因操作實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白功能摸索，通過(guò)基因修飾，人們能夠利用遺傳學(xué)辦法來(lái)有針對(duì)性地研究某一種蛋白功能，這是遺傳學(xué)特異性。而化學(xué)基因組學(xué)中所研究小分子則不一定都能做到與靶蛋白特異性結(jié)合。目前，化學(xué)遺傳學(xué)辦法主要缺陷是不能象遺傳學(xué)那樣直接應(yīng)用，例如，采取小分子化合物誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生新細(xì)胞表型，無(wú)法通過(guò)遺傳辦法擴(kuò)大生產(chǎn)方便繼續(xù)研究細(xì)胞內(nèi)生物過(guò)程。另外，由于生物體內(nèi)許多蛋白質(zhì)含量相稱(chēng)低，對(duì)某些未知蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，雖然能夠通過(guò)某些辦法判定出它基本性質(zhì)，不過(guò)假如不能通過(guò)基因重組辦法得到足夠量樣品，繼續(xù)深入研究將是十分困難。85/138二、正向化學(xué)遺傳學(xué)傳統(tǒng)正向遺傳學(xué)(forwardgenetics)是從細(xì)胞特定形態(tài)“表型”(phenotype)出發(fā)，最后達(dá)成分離有關(guān)基因或基因群目標(biāo)。例如，科學(xué)家們通過(guò)對(duì)果蠅卵進(jìn)行放射處理來(lái)誘導(dǎo)隨機(jī)性基因突變，假如科學(xué)家們對(duì)果蠅翅膀發(fā)育有愛(ài)好，他們將從通過(guò)放射處理卵所孵化果蠅當(dāng)中選擇那些翅膀有缺陷個(gè)體(如翅膀較小個(gè)體)，并對(duì)果蠅基因組進(jìn)行掃描，找出發(fā)生變異基因。一旦某個(gè)基因被確定并分離出來(lái)，將會(huì)開(kāi)展某些能夠表白這一基因?qū)Τ岚蛘０l(fā)育有主要影響試驗(yàn)。86/138正向遺傳學(xué)辦法

它研究過(guò)程一般分三步來(lái)實(shí)現(xiàn)。首先，促使細(xì)胞和機(jī)體組織隨機(jī)突變(例如通過(guò)x射線(xiàn)照射方式)；然后，選擇具有特定表型細(xì)胞或機(jī)體來(lái)進(jìn)行深入研究；最后，確定引發(fā)特定突變基因。87/13888/138正向化學(xué)遺傳學(xué)目標(biāo)是找到對(duì)生物活性小分子敏感蛋白，其基本思緒是：先用一系列小分子來(lái)處理所要研究細(xì)胞或有機(jī)體，然后判定出所需要表型，最后找出生物活性小分子所作用靶蛋白。正向化學(xué)遺傳學(xué)89/138正向化學(xué)遺傳法本身具有較高發(fā)覺(jué)能力，由于它不需要預(yù)先懂得太詳細(xì)生物機(jī)理，就能夠找到能與小分子作用包括在某一特定過(guò)程中已知蛋白，還能夠找到在該過(guò)程中未知蛋白。正向化學(xué)遺傳學(xué)同步還提供了能夠干擾靶蛋白新工具分子，它面臨挑戰(zhàn)是能否找到高效精確地確定新表型辦法。90/1381，正向化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)例-myoseverin發(fā)覺(jué)

（1）2,6,9-三取代嘌呤庫(kù)構(gòu)建堿基是核苷酸基本構(gòu)造單位之一，已有許多經(jīng)構(gòu)造修飾堿基成為藥品,并在抗菌及抗腫瘤中起著主要作用。Chang和Schultz等人以幾個(gè)細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶（CDKs）和其天然抑制劑Olimoucine為基礎(chǔ)，選擇嘌呤環(huán)作為多樣性合成骨架，將固載化胺與2-氟-6-氯嘌呤反應(yīng)得到與樹(shù)脂相連嘌呤，然后引入另外兩個(gè)取代基。該辦法能夠在3個(gè)位置上引入不一樣取代基，組成了2,6,9-三取代嘌呤庫(kù)。91/13892/138（2）高通量篩選細(xì)胞周期正常運(yùn)行決定著細(xì)胞增殖、分化和凋亡,受周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclidepedentkinase,CDK)和周期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑(CDKinhibitor,CKI)在多種層次上共同調(diào)整，2,6,9-三取代嘌呤化合物能夠作為周期蛋白依賴(lài)性激酶CDK1和CDK2抑制劑而用于抗腫瘤研究。不過(guò)對(duì)于已經(jīng)分化神經(jīng)原細(xì)胞和肌肉細(xì)胞來(lái)說(shuō)，細(xì)胞很少再分裂增殖。因此,細(xì)胞一旦受傷,細(xì)胞生長(zhǎng)受到妨礙,恢復(fù)起來(lái)很難，因此，人們希望找到一種化合物來(lái)引發(fā)肌肉細(xì)胞分化,達(dá)成再生目標(biāo)。93/138骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞分化特點(diǎn)是一種單核成肌細(xì)胞融合成多核肌管過(guò)程，為了形成肌管，成肌細(xì)胞必須停頓分裂。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞體現(xiàn)肌細(xì)胞專(zhuān)一性轉(zhuǎn)錄因子，如MyoD、Myf5、MEF2、肌漿蛋白以及細(xì)胞周期調(diào)整蛋白，如周期蛋白A（cyclinA）等。這些變化造成特性性標(biāo)志物體現(xiàn)，如骨骼肌肌球蛋白重鏈(SMMHC)和乙酰膽堿受體。在兩棲動(dòng)物肢再生期間，多核肌管解體成能夠生長(zhǎng)并裂變裂成單細(xì)胞單核碎片，這就說(shuō)明在某些脊椎動(dòng)物肌肉能夠通過(guò)肌管解體再生。為了摸索在哺乳動(dòng)物細(xì)胞這種肌肉再生也許性，將2,6,9-三取代嘌呤庫(kù)用于體外篩選能夠使分化鼠肌細(xì)胞（C2C12）肌管裂變小分子化合物。94/138Rosania等人將幾百個(gè)2,6,9-三取代嘌呤類(lèi)化合物庫(kù)加入到生長(zhǎng)多天肌細(xì)胞（C2C12）96孔培養(yǎng)板上,采取MTT辦法和熒光標(biāo)識(shí)進(jìn)行細(xì)胞表型篩選，找到了一種能夠誘導(dǎo)多核肌管可逆地裂變成為單核碎片化合物，命名為myoseverin。95/138從圖中能夠看出在myoseverin處理之前,細(xì)胞連接成一種整體（圖C）,不過(guò)在肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20

mol/LMyoseverin處理24h后,能夠顯著看到細(xì)胞互相分離（圖D，而多核肌管可逆地分裂成為單核碎片（圖B）。如將化合物除去，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)介質(zhì)中后，肌管分裂促進(jìn)了DNA合成和細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)錄過(guò)程和生物化學(xué)試驗(yàn)表白單獨(dú)myoseverin并不能逆轉(zhuǎn)生物化學(xué)分化過(guò)程。Myoseverin還可影響某些生長(zhǎng)因子、免疫調(diào)整因子體現(xiàn)。事實(shí)上,myoseverin被注入組織后,一部分肌細(xì)胞就可盼望再度生長(zhǎng)并增殖,因而產(chǎn)生新肌肉組織。

96/138（3）檢查化合物相連目標(biāo)蛋白質(zhì)肌細(xì)胞表型篩選表白了myoseverin能夠使肌管裂變，不過(guò)myoseverin是與哪種細(xì)胞生物活動(dòng)過(guò)程中目標(biāo)蛋白質(zhì)發(fā)生作用呢？根據(jù)肌管細(xì)胞構(gòu)造，估計(jì)肌管裂變過(guò)程與細(xì)胞構(gòu)造骨架蛋白質(zhì)有關(guān),因此使用帶有熒光標(biāo)識(shí)抗微管抗體（綠色）觀(guān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)圖像，用Hoescht33258對(duì)細(xì)胞核內(nèi)DNA進(jìn)行染色（藍(lán)色），從而能夠清楚地看到藥品處理前后細(xì)胞形態(tài)變化。

97/138能夠看出在被myoseverin處理之前,細(xì)胞與微管緊密相連,不過(guò)以myoseverin處理過(guò)細(xì)胞體現(xiàn)出破裂微管。由于微管蛋白構(gòu)造比較復(fù)雜，因此,還不清楚myoseverin直接在微管蛋白還是其他微管結(jié)合蛋白(MAP)上發(fā)生作用。為了檢查這一點(diǎn),從細(xì)胞骨架中提取了純凈微管蛋白,它能夠在特種溶劑中組裝制造微管。因此，當(dāng)myoseverin加入時(shí),管形構(gòu)造顯著消失。因此,這證明了myoseverin直接在微管蛋白或微管上發(fā)生作用。98/138為了尋找具有生物活性分子與之互相作用靶蛋白質(zhì),首先將myoseverin上N-9位異丙基更換成一種末端具有一種氨基6個(gè)碳鏈長(zhǎng)臂，然后與溴乙?；?lài)氨酸連接，而賴(lài)氨酸

-氨基被生物素化，組成了一種親和標(biāo)識(shí)試劑（圖1-）。當(dāng)該試劑中myoseverin部分與目標(biāo)蛋白專(zhuān)一性結(jié)合后，溴乙?；糠帜軌蚺c蛋白質(zhì)中活性基團(tuán)形成共價(jià)鍵，標(biāo)識(shí)后，細(xì)胞萃取液用鏈親和素包衣磁珠處理，由于生物素與鏈親和素專(zhuān)一性作用，從而將目標(biāo)蛋白質(zhì)提取出來(lái)。99/138

2，正向化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)例-monastrol發(fā)覺(jué)

（1）1,4-二氫吡啶化合物庫(kù)構(gòu)建在1893年，Biginelli報(bào)道了一種多功能二氫嘧啶合成反應(yīng)，該反應(yīng)采取醛、

-酮酯和脲作為反應(yīng)物，在強(qiáng)酸條件下質(zhì)子溶劑中多組分縮合生成在雜環(huán)5-位具有酯基二氫嘧啶酮衍生物，該反應(yīng)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于雜環(huán)化合物合成中，其中二氫嘧啶骨架由于具有藥用性能被稱(chēng)為“Biginelli化合物”，包括抗病毒、抗腫瘤、抗菌及抗炎活性。當(dāng)用取代硫脲替代脲，并用固相合成辦法，即可構(gòu)建一類(lèi)新二氫嘧啶化合物庫(kù)。

100/138（2）高通量篩選由于核仁素(nucleolin)在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂早期將被磷酸化，假如有絲分裂過(guò)程被抑制，就會(huì)使細(xì)胞停滯在有絲分裂早期，磷酸化核仁素(phosphonucleolin)將在細(xì)胞中富積，以此為標(biāo)志，ThomasU．Mayer等采取細(xì)胞印跡技術(shù)，從16320個(gè)1,4-二氫嘧啶化合物中篩選出139種可穿透細(xì)胞以及對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂有抑制作用化合物。101/138接著，他們用體外篩選辦法排除了其中53個(gè)與微管蛋白有作用化合物(由于已知抑制微管蛋白化合物較多，沒(méi)有太高研究?jī)r(jià)值)。余下86種化合物再次加入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，將細(xì)胞染色后，在顯微鏡下觀(guān)測(cè)微管(綠色)和染色質(zhì)(藍(lán)色)分布變化，得到5種針對(duì)有絲分裂專(zhuān)一性抑制劑。102/138在Monastrol存在下，能夠使染色體只和紡錘體一極相連，中心粒復(fù)制但不能分離，形成Monoastral紡錘體。如將藥品加至體外無(wú)細(xì)胞體系，紡錘體兩極會(huì)向?qū)Ψ揭苿?dòng)直至融合在一起。103/138（3）靶點(diǎn)判定由圖可知monastrol作用與紡錘體組裝有關(guān)，紡錘體又稱(chēng)有絲分裂器(mitoticapparatus)，它是在有絲分裂期間,從中心粒形成多種微管,包括動(dòng)粒粒微管、極微管、星體微管等，它們功能是將遺傳物質(zhì)均等分派到兩個(gè)子細(xì)胞。在動(dòng)粒中,ATP分子水解能夠提供能量,驅(qū)動(dòng)微管上動(dòng)力蛋白馬達(dá)分子向兩極移動(dòng),成果是將染色體拉向兩極形成紡錘體。那么monastrol究竟作用于其中哪種蛋白呢？Klein等檢測(cè)了有沒(méi)有微管存在下ATP酶活性，發(fā)覺(jué)monastrol及其類(lèi)似物能夠抑制ATP酶活性，表白，其作用也許與有絲分裂中驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)有關(guān)。為了尋找與monastrol結(jié)合目標(biāo)蛋白，他們用NHS-活化Sepharose4FastFlow設(shè)計(jì)合成了純化蛋白質(zhì)親和層析介質(zhì)。104/138利用親和層析樹(shù)脂和未衍生化樹(shù)脂對(duì)細(xì)胞提取液進(jìn)行分離，通過(guò)電泳分析，再通過(guò)專(zhuān)一性抗Eg5等抗體對(duì)電泳分離出蛋白進(jìn)行免疫化學(xué)檢測(cè)和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，確定該蛋白為有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5，說(shuō)明Eg5不但與中心粒分離，并且與維持微管在紡錘體中區(qū)交聯(lián)都有密切關(guān)系。105/138monastrol與人驅(qū)動(dòng)蛋白KSP動(dòng)力構(gòu)造域結(jié)合晶體構(gòu)造

106/1383，正向化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)例-黑素細(xì)胞調(diào)整劑melanogenin

哺乳動(dòng)物毛皮顏色主要是由皮膚與毛發(fā)中真黑色素(褐與黑)與偽黑色素(紅與黃)相對(duì)數(shù)量與分布情況所決定。哺乳動(dòng)物黑色素合成有一種復(fù)雜調(diào)控系統(tǒng)，在黑素細(xì)胞每一種發(fā)育水平都有幾個(gè)不一樣基因來(lái)調(diào)控，反之，同一種基因產(chǎn)物在不一樣發(fā)育階段也許起不一樣作用。有研究證明，黑素生物合成受兩個(gè)基因家族調(diào)控:①酪氨酸酶基因家族，②Pmel17基因家族?目前有較多Pmel17基因家族基因與黑素瘤報(bào)道，而對(duì)黑素合成調(diào)整還不十分清楚,以為也許與酪氨酸酶基因家族有關(guān)?107/138由于黑色素形成主要發(fā)生在黑色素細(xì)胞內(nèi)，對(duì)黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素形成機(jī)理研究表白，黑色素形成主要是由黑色素細(xì)胞內(nèi)四種酶：酪氨酸酶?多巴異構(gòu)酶(TRP-2)?過(guò)氧化物酶?5,6-二羥基吲哚-2-羧酸即DHICA氧化酶(TRP-1)等酶單獨(dú)或協(xié)同作用成果。根據(jù)黑素細(xì)胞發(fā)育、黑素體遷移、信號(hào)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子以及黑色素合成所包括到蛋白，目前，黑色素生物合成化學(xué)調(diào)控主要集中在下列幾個(gè)方面，以達(dá)成刺激黑色素合成或抑制黑色素合成以及色素沉積目標(biāo)。108/138109/138110/138111/138112/138靶點(diǎn)驗(yàn)證Prohibitin(phb)基因是一種有效腫瘤抑制基因，廣泛分布于不一樣種屬多種生物細(xì)胞中，它所編碼產(chǎn)物Prohibitin(PHB)蛋白構(gòu)造保守，既存在于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上，發(fā)揮分子伴侶作用，也存在于細(xì)胞核內(nèi)。具有負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,因而對(duì)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、分化、衰老以及凋亡等很多方面發(fā)揮著主要調(diào)控作用，也許與某些腫瘤和退行性疾病發(fā)生有關(guān)。113/138

黑色素生物合成過(guò)程活性調(diào)控動(dòng)物身體及組織器官內(nèi)累積天然有色顆粒。例如昆蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)及獸類(lèi)等，有著各式各樣顏色，包括保護(hù)色和警戒色。這都是由于此類(lèi)色素本身化學(xué)作用，以及皮膚和外部羽、毛、鱗等對(duì)光反射及干擾等物理作用形成。114/138為何有動(dòng)物具有如此有趣保護(hù)色？為何有動(dòng)物還會(huì)變幻顏色？它秘密在哪里？在動(dòng)物皮毛皮質(zhì)層錠狀細(xì)胞壁上，有天然色素，它們是棕色和黑色兩種色素。色素存在狀態(tài)不一樣樣，顆粒狀顏色深，擴(kuò)散狀顏色淺。根據(jù)色素不一樣狀態(tài)，棕色色素就能使皮毛顯現(xiàn)出黃、棕、棕黃等顏色，而黑色素就能使皮毛顯現(xiàn)出黑色和灰色。假如兩種色素都存在，要看哪一種發(fā)達(dá)，棕色素發(fā)達(dá)皮毛是棕色，黑色素發(fā)達(dá)皮毛是土黃色，兩種色素都沒(méi)有，皮毛是白色。115/138皮膚構(gòu)造116/138117/138118/138酪氨酸酶抑制劑119/138天然植物提取液銀杏提取液：內(nèi)含白果酸,白果酚丁酸,辛酸等。用于化裝品有在增白養(yǎng)顏、抗衰老等效果。甘草提取液：內(nèi)含多種黃酮類(lèi)化合物，它能抑制酪氨酸酶活性,是一種迅速、高效美白化裝品添加劑。綠茶提取液：具有茶多酚類(lèi)化合物，并具有保濕，抗炎，洗滌，護(hù)發(fā)，減肥等藥理作用。當(dāng)歸、川芎、沙滲、柴胡、防風(fēng)提取液等。120/138調(diào)控小鼠毛顏色121/138三、反向化學(xué)遺傳學(xué)化學(xué)遺傳學(xué)也能夠利用已知靶蛋白來(lái)尋找與其互相作用小分子，這一過(guò)程與傳統(tǒng)遺傳學(xué)中反向篩選法相類(lèi)似，因此又被為反向化學(xué)遺傳學(xué)或反向化學(xué)基因組學(xué)。反向遺傳學(xué)是從分析某一種特定基因出發(fā)，以發(fā)覺(jué)該基因在產(chǎn)生突變后所引發(fā)形態(tài)學(xué)變化為目標(biāo)。

122/138這個(gè)過(guò)程一般分三步來(lái)實(shí)現(xiàn)。第一，選擇一種感愛(ài)好基因，第二，培養(yǎng)該基因變異細(xì)胞或生物體，一般能夠通過(guò)基因敲除(knock-out)或者過(guò)度體現(xiàn)(overexpression)辦法來(lái)實(shí)現(xiàn)；第三，比較變異細(xì)胞或生物體表型與野生型細(xì)胞或生物體在表型上差異，從而確定該基因在細(xì)胞或生物體內(nèi)功能。

123/138反向化學(xué)遺傳學(xué)篩選第一步就是確定一種感愛(ài)好蛋白作為靶蛋白，然后根據(jù)該蛋白構(gòu)造合成一種化合物庫(kù)，庫(kù)中分子在構(gòu)造、電性和疏水性等方面要與靶蛋白在空間和理化性質(zhì)相匹配。這樣合成設(shè)計(jì)被稱(chēng)之為“目標(biāo)導(dǎo)向合成(target-orientedsynthesis)”，利用這樣篩選模型，人們就能夠從合成化合物庫(kù)中找出某些能調(diào)整該蛋白功能化合物。假如以靶蛋白為藥品靶點(diǎn)，那么反向化學(xué)遺傳學(xué)篩選出小分子最后就也許是一種潛在藥品先導(dǎo)化臺(tái)物。因此，此類(lèi)辦法在藥品設(shè)計(jì)中應(yīng)用很廣泛，如受體激動(dòng)劑和拮抗劑、酶激活劑和抑制劑等，

124/138125/1381,反向化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)例-purvalanol發(fā)覺(jué)（1）2,6,9-三取代嘌呤庫(kù)構(gòu)建見(jiàn)實(shí)例-myoseverin發(fā)覺(jué)。由于嘌呤堿基不不過(guò)組成核酸基本組成成份，并且許多輔酶，如煙酰胺二磷酸腺苷（NAD+）、黃素二磷酸腺苷以及輔酶A都具有腺苷成份，生物體內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）不但為機(jī)體活動(dòng)提供能量，也直接參與眾多合成反應(yīng)來(lái)調(diào)控細(xì)胞生化反應(yīng)過(guò)程，如蛋白激酶催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)。多取代嘌呤具有與ATP相同構(gòu)造，能夠與ATP競(jìng)爭(zhēng)酶活性中心結(jié)合部位，從而達(dá)成抑制酶催化反應(yīng)目標(biāo)。126/138（2）CDK(細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶)抑制劑篩選在細(xì)胞周期中包括到多種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK），它們參與周期各個(gè)時(shí)期生化反應(yīng)調(diào)控作用。腫瘤細(xì)胞增殖就是調(diào)控失衡造成，外部環(huán)境如細(xì)胞因子等促進(jìn)