鉤吻素子在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)及組織分布

鉤吻素子在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)及組織分布

鉤子，方程c。1材料和方法1.1材料表面1.1.1儀器、試藥與儀器鉤吻素子由本實驗室自閩產(chǎn)野生鉤吻植物中提取,純度99.1%;甲醇(色譜純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙酸乙酯(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);氨水(汕頭市西隴化工廠有限公司)。高效液相色譜儀(LC-20A,日本島津公司);電子分析天平(BP310S型,北京塞多利斯天平公司);氮?dú)獯蹈蓛x(HGC-24A型,天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);臺式高速離心機(jī)(TGL-16C型,上海安亭科學(xué)儀器廠);旋渦混合儀(WH-2微型,上海滬西分析儀器廠);自動勻漿器(Art-MiccraD-8型,德國MICCRA公司)。1.1.2動物損害測試雄性SD大鼠,6~7周齡,體質(zhì)量180~200g,清潔級[上海斯萊克實驗動物有限公司,動物質(zhì)量合格證號:SCXK(滬)2007-0005]。實驗前禁食12h,不禁水。1.2方法1.2.1樣品前處理及分組血漿樣品采集與預(yù)處理:大鼠6只,灌胃給予15mg/kg鉤吻素子,于給藥后第5,9,12,15,30,45,60,150,240,330和420min眼眶靜脈取血約0.5mL于肝素處理的試管中,4000r/min離心5min,取100μL血漿,加5mol/L氫氧化鈉溶液10μL調(diào)pH至10~12,加1mL乙酸乙酯,渦旋混勻5min,10000r/min離心10min,取上清60℃氮?dú)鈸]干,殘渣以100μL流動相復(fù)溶,0.25μm微孔濾膜過濾,取濾液10μL進(jìn)樣。組織樣品采集與預(yù)處理:大鼠18只,隨機(jī)分成3組,每組6只。大鼠灌胃給予15mg/kg鉤吻素子,3組大鼠分別于灌胃給藥后第5,15和60min斷頭處死,取肝、腎、肺、腦、睪丸、骨骼肌、胃、小腸、體脂、心、脾組織,生理鹽水沖洗(其中小腸和胃需去除內(nèi)容物),濾紙吸干,稱質(zhì)量,按1∶1(W/V)加入生理鹽水冰浴勻漿,取100μL勻漿液進(jìn)行預(yù)處理,方法同上述血漿樣品的預(yù)處理。1.2.2血液和組織樣品流動相色譜柱:AmethystC18柱(150mm×4.6mm,5μm);柱溫:30℃。血液樣品檢測流動相:甲醇∶水∶氨水=55∶45∶0.05(V/V);組織樣品檢測流動相:甲醇∶水∶氨水=45∶55∶0.05(V/V);流速1.0mL/min。紫外檢測波長:256nm。1.2.3專屬性、線性關(guān)系、回收率和穩(wěn)定性試驗為驗證HPLC測定血漿樣品鉤吻素子含量的方法學(xué),進(jìn)行專屬性、線性關(guān)系及靈敏度、精密度、回收率和穩(wěn)定性試驗。為驗證HPLC測定組織樣品鉤吻素子含量的方法學(xué),進(jìn)行專屬性、線性關(guān)系、精密度和回收率試驗。1.3統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)采用ue0af±s表示。選用Kinetia4.4藥代動力學(xué)軟件(ThermoElectron公司)計算藥動學(xué)參數(shù)。2結(jié)果2.1hplc生物樣品鉤子含量的方法學(xué)證實2.1.1線性關(guān)系和定量限本色譜條件下鉤吻素子的保留時間為9.2min,血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對檢測無干擾,方法的專屬性良好;在0.06~10.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表1),定量限為0.06μg/mL;鉤吻素子0.08,2.00和10.00μg/mL的日內(nèi)和日間精密度RSD均<9%,鉤吻素子0.08,2.00和10.00μg/mL提取回收率為80.03%~83.55%,方法回收率為99.21%~110.36%,鉤吻素子0.08,2.00和10.00μg/mL室溫、凍融和長期保存穩(wěn)定性的測定結(jié)果變化均在允許范圍內(nèi)。2.1.2線性關(guān)系良好本色譜條件下鉤吻素子的保留時間為19.7min,組織中的內(nèi)源性物質(zhì)對檢測無干擾,方法的專屬性良好;在0.08~5.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表1);鉤吻素子0.08,1.00和5.00μg/mL的日內(nèi)和日間精密度RSD均<8%,鉤吻素子0.08,1.00和5.00μg/mL提取回收率為64.20%~76.82%,方法回收率為91.87%~109.25%。2.2藥代動力學(xué)分析鉤吻素子的血藥濃度-時間曲線見圖1。大鼠單次灌胃給予15mg/kg鉤吻素子,約15min后鉤吻素子血藥濃度達(dá)峰;隨后血藥濃度迅速下降,而在灌胃給藥1h后血藥濃度下降緩慢。經(jīng)Kinetica4.4藥代動力學(xué)軟件分析處理,以AIC最小原則為指標(biāo),結(jié)果表明灌胃給予鉤吻素子在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)符合二室模型(權(quán)重W為1),其主要藥物動力學(xué)參數(shù)如下:計算的達(dá)峰時間為(19.95±0.53)min,計算的峰濃度為(0.69±0.03)μg/mL,表觀分布容積為(10.45±0.36)L/kg,分布相半衰期為(7.65±0.47)min,消除相半衰期為(234.11±17.37)min,清除率為(0.031±0.003)L·min3樣品的生物組織化鉤吻素子生物樣品的預(yù)處理方法,Chen等采用甲醇沉淀的方法血漿鉤吻素子的含量測定方法,Chen等采用超高效液相色譜-質(zhì)譜(Ultra-performanceliquidchromatography-massspectrometry,UPLC-MS/MS)法組織鉤吻素子的含量測定方法,本研究系在血漿樣品測定方法上優(yōu)化而來。用血漿樣品的色譜條件檢測組織樣品,發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)源性物質(zhì)可干擾鉤吻素子的檢測,通過降低甲醇的比例,流動相從甲醇∶水∶氨水=55∶45∶0.05(V/V)改為甲醇∶水∶氨水=45∶55∶0.05(V/V),可提高鉤吻素子的分離度,避免內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。楊櫻等報道HPLC測定大鼠肝微粒體中鉤吻素子含量的方法,但該方法保留時間約為40min,等待時間長,所用流動相為乙腈∶0.1%三乙胺=20∶80(V/V),其中乙腈毒性較高,三乙胺雖可以作為掃尾劑減少峰拖尾,但也增加了分析方法的復(fù)雜性和損傷色譜柱的可能性利用本研究建立的血漿鉤吻素子含量HPLC檢測法,進(jìn)行鉤吻素子單次灌胃給予大鼠的體內(nèi)藥動學(xué)研究,觀察到鉤吻素子在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)符合二室模型,達(dá)峰時間短,提示鉤吻素子的吸收迅速,起效快;表觀分布容積大,提示鉤吻素子廣泛分布,與實際組織分布測定的結(jié)果相吻合;消除半衰期約為4h,與筆者所在課題組觀察到鉤吻素子單次用藥對神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛持效時間5.5h相接近(另文報道)。本研究報道的單次灌胃給予大鼠15mg/kg鉤吻素子的藥動學(xué)參數(shù)與Chen等單次靜脈注射給予大鼠20mg/kg鉤吻素子的藥動學(xué)參數(shù)比較利用本研究建立的組織鉤吻素子含量HPLC檢測法,進(jìn)行鉤吻素子單次灌胃給予