核酸血液篩查(上海浩源)課件

核酸血液篩查23August2023P12023/8/23核酸血液篩查01August2023P12023/8/1分子生物學(xué)概論一核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)二三

目錄P2核酸血液篩查系統(tǒng)23August2023四血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存三PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治2023/8/23分子生物學(xué)概論一核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)二三目

分子生物學(xué)概論P(yáng)323August2023

核酸的分子組成-核苷酸2023/8/23分子生物學(xué)概論P(yáng)301Augus

分子生物學(xué)概論P(yáng)423August2023

DNA的一級結(jié)構(gòu)CytosineAdenineThymineGuanineHydrogenBondsDeoxyribose(Sugarmolecule)PhosphoricAcid(Phosphatemolecule)由A/T/G/C四種單核苷酸組成2023/8/23分子生物學(xué)概論P(yáng)401Augus

分子生物學(xué)概論

DNA的二級結(jié)構(gòu)P523August2023DNA分子由相互平行、走向相反、堿基互補(bǔ)的兩條脫氧核糖核苷酸鏈圍繞同一中心軸，盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋的一側(cè)為大溝，另一側(cè)為小溝。平行鏈對應(yīng)堿基總是A==T、G===C配對（basepairing)或互補(bǔ)，形成穩(wěn)定聯(lián)系。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)2023/8/23分子生物學(xué)概論P(yáng)623August2023分子生物學(xué)概論

核酸的理化性質(zhì)DNA的熱變性與復(fù)性DNA熱變性后緩慢冷卻處理過程稱退火annealingDNA加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補(bǔ)鏈堿基之間來不及配對互補(bǔ)，形成氫鍵聯(lián)系，兩鏈維持分離狀態(tài)。慢驟2023/8/23P601August2023

分子生物學(xué)概論

P723August2023核酸分子雜交hybridization

當(dāng)不同來源的核酸變性后一起復(fù)性時(shí)，只要這些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成堿基配對，出現(xiàn)復(fù)性現(xiàn)象，形成雜種核酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。2023/8/23分子生物學(xué)概論

分子生物學(xué)概論

P823August2023

DNA半保留復(fù)制DNA合成進(jìn)行時(shí)，以兩條親代DNA鏈中的每—條鏈為模板，在DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶催化下，按A與T、G與C堿基配對原則合成子代DNA的過程稱DNA的復(fù)制(replication)。由于復(fù)制合成的子代DNA兩條脫氧核糖核苷酸鏈中有一條來自親代DNA，另一條是以前者為模板新合成的子代DNA鏈，所以DNA的這種合成作用又稱半保留復(fù)制(semiconservativereplication)。2023/8/23分子生物學(xué)概論P(yáng)8

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P923August2023核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)磁珠法提取核酸熒光PCR技術(shù)與TMA技術(shù)UNG-dUTP防污染系統(tǒng)內(nèi)對照分子2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P90

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1023August2023

磁珠法提取核酸樣品核酸提取磁珠法2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P10

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1123August2023

磁珠法提取核酸第一步：細(xì)胞的裂解：破碎細(xì)胞，并向溶液中加入磁珠。

第二步：結(jié)合核酸：pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P11

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1223August2023

磁珠法提取核酸第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復(fù)多次）。第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來。2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P12

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1323August2023

PCR技術(shù)5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’加入試管中2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P13

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1423August2023

PCR技術(shù)循環(huán)循環(huán)延伸5’3’5’3’5’3’5’3’繼續(xù)延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P14

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1523August2023

PCR技術(shù)5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二個(gè)循環(huán)4個(gè)拷貝第三個(gè)循環(huán)8個(gè)拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個(gè)循環(huán)2n個(gè)拷貝2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P15

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1623August2023

PCR技術(shù)2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P16

分子生物學(xué)概論

P1723August2023

TMA技術(shù)2023/8/23分子生物學(xué)概論P(yáng)1

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1823August2023

TMA與PCR比較2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P1

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1923August2023

熒光PCR技術(shù)SYBRGREENMolecularbeacon2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P19

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2023August2023TaqMan熒光PCR技術(shù)2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P2

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2123August2023

TaqMan熒光PCR技術(shù)5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P2

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2223August2023

TaqMan熒光PCR技術(shù)5’3’5’3’ExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lR5’3’RQ2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P2

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2323August2023

熒光定量PCR技術(shù)一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P230

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2423August2023

CT值與閾值CT值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P2

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2523August2023

CT值與閾值實(shí)驗(yàn)操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)（圖）。“基線上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值。2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P25

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2623August2023

熒光定量PCR檢測流程圖2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P260

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2723August2023

UNG-dUTP防污染系統(tǒng)UUUU50℃,2minUNGUNG：Uracil-DNA

Glycosylase，也稱為UDG，尿嘧啶糖基化酶2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P2

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2823August2023

UNG生化特性1234無作用：游離U、A、T、G、C和RNA不耐熱：37-50℃95℃分子量小球蛋白發(fā)揮作用不依賴于Mg2+作用范圍：單鏈和雙鏈U堿基糖苷鍵2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P28

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2923August2023dUTP-UNG系統(tǒng)實(shí)施的必要性產(chǎn)物污染交叉污染試劑污染天然核酸的污染實(shí)驗(yàn)室污染物理分區(qū)紫外線照射高壓消毒10%次氯酸鈉DNaseI消化UNG消化2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3023August2023dUTP-UNG作用原理特異地識別DNA分子中尿嘧啶核苷切割下來，形成自由的尿嘧啶和“糖-磷酸”骨架加熱或堿性條件下，DNA在“糖-磷酸骨架”處斷裂模板無法擴(kuò)增dUTP代替dTTP擴(kuò)增，形成UNG有效作用底物U-DNA2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P3

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3123August2023dUTP-UNG作用示意圖2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P3

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3223August2023dUTP-UNG優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)TextText防止含dU產(chǎn)物的污染不影響目的片段的擴(kuò)增作用條件簡單，易實(shí)現(xiàn)。只防自身產(chǎn)物的污染，不防天然產(chǎn)物的污染。若混有核酸酶，會同時(shí)分解目的產(chǎn)物。UNG致使CT值增加，易導(dǎo)致假陰性。dUTP在對GC豐富的模板時(shí)作用不大。滅活不夠完全。相對用dTTP，成本高。VS2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P3

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3323August2023內(nèi)對照分子TextText內(nèi)參照的概念人工合成的小片段DNA，放在反應(yīng)液中和待測目的基因一起擴(kuò)增。內(nèi)對照是PCR方法檢測疾病基因的必需成分，是防止假陰性、提高檢測結(jié)果可靠性的重要標(biāo)示。內(nèi)對照對整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，包括樣品提取、分裝、PCR熱循環(huán)儀孔間差、PCR抑制元素等等可能的影響因素進(jìn)行監(jiān)控，防止假陰性，提高安全性2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P3

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3423August2023

競爭性內(nèi)對照分子3’5’5’3’3’5’120291310(BP)兩端為特異性引物目的基因片段

內(nèi)對照順序競爭性內(nèi)對照的概念與目的基因使用相同的引物。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與目的基因不同，可用不同的探針檢測。2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P3

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3523August2023

競爭性內(nèi)對照分子3’5’5’3’3’5’120291310(BP)內(nèi)對照特異性引物目的基因片段

內(nèi)對照順序非競爭性內(nèi)對照的概念與目的基因使用不同的引物。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與目的基因不同，可用不同的探針檢測。目的基因特異性引物2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P3

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3623August2023內(nèi)對照分子內(nèi)對照的作用真實(shí)反應(yīng)擴(kuò)增效率避免假陰性：假陰性是目前血液篩查中最重視的問題之一，內(nèi)標(biāo)全程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控質(zhì)控血篩核酸檢測的內(nèi)對照設(shè)計(jì)理念中心理念：監(jiān)測全程的實(shí)驗(yàn)過程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、及擴(kuò)增過程的效率。內(nèi)對照選用：最好能達(dá)到上述三個(gè)條件，且能顧及仿真病毒的安全性。2023/8/23核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)P3

核酸血液篩查系統(tǒng)

P3723August2023核酸血液篩查系統(tǒng)核酸檢測樣本匯集設(shè)備自動化核酸提取設(shè)備PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測設(shè)備2023/8/23核酸血液篩查系統(tǒng)P3701

核酸血液篩查系統(tǒng)

P3823August2023

核酸血液篩查系統(tǒng)分析后采集容器采集方式保存運(yùn)輸不合格樣本：脂血、溶血、樣本量不足樣本分析中分析前檢測結(jié)果純化試劑準(zhǔn)備儀器維護(hù)自檢準(zhǔn)備：質(zhì)控樣本試劑前處理混樣信息錄入擴(kuò)增檢測核酸純化檢測系統(tǒng)試劑`設(shè)備質(zhì)控品檢測試劑的準(zhǔn)備2023/8/23核酸血液篩查系統(tǒng)P38

核酸血液篩查系統(tǒng)

P3923August2023核酸檢測樣本匯集設(shè)備加樣器HAMILTON液體工作站2023/8/23核酸血液篩查系統(tǒng)P39

核酸血液篩查系統(tǒng)

P4023August2023自動化核酸提取設(shè)備自動化核酸提取(EZbeadsystem-32)2023/8/23核酸血液篩查系統(tǒng)P40

核酸血液篩查系統(tǒng)

P4123August2023PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測設(shè)備ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀2023/8/23核酸血液篩查系統(tǒng)P41血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存

P4223August2023血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存樣本的采集樣本的運(yùn)送樣本的接收與保存2023/8/23血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存P4201A血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存

P4323August2023關(guān)注采集、保存、運(yùn)輸?shù)募?xì)節(jié)運(yùn)輸條件離心采血管2023/8/23血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存P4301A

P4423August2023

標(biāo)本的采集-采血管無菌真空采血管一、血清管普通血清管帶分離膠的血清管二、抗凝管

EDTA2K或3K抗凝管

EDTA2K抗凝間分離膠（PPT)

枸櫞酸鈉抗凝管血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/8/23P4401August2023標(biāo)本的采集-

P4523August2023標(biāo)本的采集-離心離心條件

800-1600g20min離心分離的時(shí)間要求—HCVRNA和HIVRNA研究方式不同（樣本、檢測）結(jié)論差異大離心時(shí)間完成地點(diǎn)血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/8/23P4501August2023標(biāo)本的采集-離

P4623August2023

標(biāo)本的運(yùn)送2-8°C穩(wěn)定48hr

血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/8/23P4601August2023標(biāo)本

P4723August2023標(biāo)本的接收、保存確認(rèn)標(biāo)本數(shù)量運(yùn)輸狀態(tài)標(biāo)本狀態(tài)：溶血、脂血保存：用于檢測的樣本管：檢測前保存用于留樣備查的樣本：樣本量血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/8/23P4701August2023標(biāo)本的接收、保

P4823August2023檢測前核對狀態(tài)標(biāo)識接收時(shí)間離心后至檢測前2-8°C保存不超過48小時(shí)血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/8/23P4801August2023檢測前核對狀態(tài)

P4923August2023長期留樣樣本理論上-80°C保存量：核酸檢測樣本量比酶免確認(rèn)實(shí)驗(yàn)大長期保存：保存管密閉程度血站核酸檢測樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/8/23P4901August2023長期留樣樣本理

PCR實(shí)驗(yàn)室污染防治

P5023August2023PCR實(shí)驗(yàn)室污染防治PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)實(shí)驗(yàn)室人員基本要求PCR實(shí)驗(yàn)室管理核酸擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控2023/8/23PCR實(shí)驗(yàn)室污染防治

PCR實(shí)驗(yàn)室污染防治

P5123August2023PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū) 一個(gè)基本符合要求的PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)包括3~4個(gè)區(qū)

試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)在物理空間上完全互相獨(dú)立，使用功能上互相分割各區(qū)之間不能有空氣直接相通各區(qū)使用的儀器設(shè)備、移液器、Tip、試管架、筆記本、記號筆、手套等包括清潔用物品都必需執(zhí)行專區(qū)專用原則。2023/8/23PCR實(shí)驗(yàn)室污染防治

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治

P5223August2023理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)2023/8/23PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治P

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治

P5323August2023理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)B產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)2023/8/23PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治P53

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治

P5423August2023核酸擴(kuò)增