環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能的影響

環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能的影響

在動(dòng)物和家禽養(yǎng)殖中，免疫增強(qiáng)劑主要用于提高動(dòng)物身體的免疫功能。動(dòng)物免疫抑制模型的建立是評(píng)價(jià)免疫增強(qiáng)劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫功能提高效果的重要環(huán)節(jié)。已有研究表明,利用物理、化學(xué)和輻射等造模手段導(dǎo)致小鼠暫時(shí)性處于免疫低下狀態(tài),比遺傳性小鼠免疫低下更易于獲得,因而被廣泛應(yīng)用1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小鼠60只,SPF級(jí),雌雄各半,體重18~22g,購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2血清hyclwell環(huán)磷酰胺(注射用粉針,上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(Hyclone),臺(tái)盼藍(lán)、MTT、SDS、ConA、Tris均為Sigma公司產(chǎn)品,L-谷氨酰胺,青霉素,鏈霉素及其他國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭９缺D(zhuǎn)氨酶(賴氏法)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(賴氏法)試劑盒、尿素氮(二乙?！糠?試劑盒、肌酐(苦味酸法)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程有限公司。1.3環(huán)磷酰胺高劑量單次給藥試驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只。第1組為空白對(duì)照組,腹腔注射生理鹽水;第2~5組分別按10、20、30、40mg/(kg·BW)的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液,每天1次,連續(xù)給藥7d;第6組為環(huán)磷酰胺高劑量單次給藥對(duì)照組,試驗(yàn)第1天按150mg/(kg·BW)的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺1次,之后6d注射相同體積的生理鹽水。各組小鼠正常飼養(yǎng)7d。1.4在測(cè)試第8天，測(cè)定免疫器官指數(shù)和肝腎功能的主要指標(biāo)，并將它們放在小鼠眼睛上。分離血清并將其保存頸椎脫臼處死小鼠,取脾臟、胸腺,稱重,計(jì)算免疫器官指數(shù)。檢測(cè)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐的含量。1.5紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的檢測(cè)取小鼠血液0.02mL,加入3%乙酸溶液0.38mL稀釋血液,用小滴管從搖勻的稀釋液中吸取少量液體加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池內(nèi),靜置1~2min,在顯微鏡下用低倍鏡計(jì)數(shù)4個(gè)大方格的白細(xì)胞總數(shù),然后將該數(shù)值乘以50,即得每立方毫米的白細(xì)胞數(shù)。1.6分離細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液頸椎脫臼法處死小鼠,取脾臟,置于含5mLPBS液的滅菌平皿中,在200目不銹鋼網(wǎng)上研磨并過(guò)篩,制成單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液,1500r/min離心8min,棄上清液。加入10倍體積Tris-NH1.7組試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS21.0軟件,采用方差分析法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著,P<0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。試驗(yàn)結(jié)果以u(píng)e003±SD表示。2結(jié)果與分析2.1小鼠臟器指數(shù)由表1可知,腹腔注射環(huán)磷酰胺后,第2~6組小鼠的胸腺指數(shù)均極顯著低于第1組(P<0.01),第2~5組小鼠的脾臟指數(shù)均極顯著低于第1組(P<0.01);第2~5組小鼠的脾臟指數(shù)均極顯著低于第6組(P<0.01)。結(jié)果提示,低劑量多次注射以及高劑量單次注射環(huán)磷酰胺均可對(duì)小鼠的免疫器官發(fā)育產(chǎn)生抑制作用,且低劑量多次注射的抑制效果優(yōu)于高劑量單次注射。同時(shí),在低劑量多次注射時(shí),環(huán)磷酰胺劑量越高,對(duì)小鼠免疫器官發(fā)育的抑制作用越強(qiáng)。2.2表2顯示，2.6組小鼠血清谷草的旋轉(zhuǎn)含量與第一組p.0.01顯著增加。第四組大鼠血清谷草的旋轉(zhuǎn)含量顯著高于第一組p.0.05。第二組六頭大鼠的血清谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶含量顯著高于第一組p.0.01。第二組和第五組大鼠血清尿素氮含量均高于第一組p.0.01。第二組和第五組大鼠血清尿素氮含量均高于第一組p.0.01。第二組和第五組大鼠的血清肌肉素氮含量顯著高于第一組p.0.01。第二組和第五組大鼠的血清肌肉素含量差異不顯著p.0.05，第六組小鼠的血清肌肉素含量顯著低于第一組p.0.05。結(jié)果表明，低劑量藥物和高劑量藥物環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠的肝臟和腎臟功能有一定的影響2.3表3顯示，在服用環(huán)磷酰胺后，2.6組小鼠的白細(xì)胞數(shù)量有所減少。其中，第2組、第5組和第6組小鼠的紅細(xì)胞數(shù)量與第1組p.0.01相差很大，第3組和第4組小鼠的紅細(xì)胞數(shù)量與第1組p.0.05之間存在顯著差異。因此，即使服用低劑量藥物和高劑量藥物，低劑量也會(huì)減少小鼠血液中的白細(xì)胞數(shù)量2.4小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率由表4可知,第2~5組小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與第1組相比均有一定程度的降低,其中,第4組小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率極顯著低于第1組(P<0.01),第2組和第5組小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著低于第1組(P<0.05);第6組小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率極顯著高于第1組(P<0.01);第2~5組小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均極顯著低于第6組(P<0.01)。結(jié)果提示,低劑量多次注射環(huán)磷酰胺可在一定程度上降低小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。3免疫抑制模型的建立環(huán)磷酰胺是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物,是聯(lián)合化療、手術(shù)和放療輔助化療的常用藥物之一,具有廣譜的抗癌作用。此外,環(huán)磷酰胺還具有較強(qiáng)的免疫抑制作用。由于類似于多糖的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)應(yīng)用的對(duì)象主要是機(jī)體免疫功能下降的個(gè)體,所以其功效的評(píng)價(jià)過(guò)程中應(yīng)選用免疫功能低下的動(dòng)物模型進(jìn)行試驗(yàn)。然而多糖類免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的起效周期較長(zhǎng),因此,需要選擇一種效果明顯、維持時(shí)間長(zhǎng)的免疫抑制模型,從而為免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)功能的評(píng)價(jià)提供更好的參考依據(jù)?，F(xiàn)有的模型多采用一次性注射高劑量藥物造模免疫器官指數(shù)表現(xiàn)免疫器官的發(fā)育狀況,間接地反映了機(jī)體的免疫狀態(tài)。環(huán)磷酰胺屬于免疫抑制性藥物,對(duì)小鼠的免疫器官,如胸腺、脾臟的發(fā)育均具有抑制作用。該研究結(jié)果表明,腹腔注射不同劑量的環(huán)磷酰胺后,小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組相比極顯著降低,且多次注射不同劑量的環(huán)磷酰胺,小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)隨著注射劑量的增加而降低,表明多次給藥時(shí),高劑量環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用強(qiáng)于低劑量。而單次注射高劑量的環(huán)磷酰胺,小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)高于低劑量多次注射,這有可能是免疫抑制維持的時(shí)間不夠長(zhǎng)致使小鼠免疫力恢復(fù)。注射環(huán)磷酰胺后,各組小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮含量均呈現(xiàn)一定程度的升高,由此可知,環(huán)磷酰胺可以造成一定程度上的肝腎功能損傷。此外,環(huán)磷酰胺也可造成小鼠血液白細(xì)胞數(shù)量減少。淋巴細(xì)胞只有向成熟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化才能發(fā)揮免疫效應(yīng),因此,脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo),其活化過(guò)程可能是:T細(xì)胞與抗原或有絲分裂原結(jié)合,導(dǎo)致DNA合