產(chǎn)膽固醇氧化酶菌株的復(fù)合誘變選育

產(chǎn)膽固醇氧化酶菌株的復(fù)合誘變選育

膽固醇酶（cod，ec1.1.3.6）是測定膽固醇代謝過程的重要酶，能夠特異性地轉(zhuǎn)化為膽固醇。-4-烯-3-烯（膽甾醇）和h。目前報道的產(chǎn)膽固醇氧化酶的微生物多是鏈霉菌和短桿菌,其他菌種研究的較少。2001年,TabatabaeiYM等1材料和方法1.1實驗材料1.1.1細(xì)菌1.1.2主試劑亞硝基胍(NTG)購自德國Fluka公司;辣根過氧化物酶購自上海雙向西巴斯科技發(fā)展有限公司1.1.3培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl5,蒸餾水1L,pH7.5.完全培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl5,瓊脂20,蒸餾水1L,pH7.5.發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):膽固醇3,酵母膏8,NaCl1,CH1.2實驗方法1.2.1子培養(yǎng)基的培養(yǎng)完全培養(yǎng)基斜面活化48h,接一環(huán)到50mL種子培養(yǎng)基中,30℃200r/min振蕩培養(yǎng)14h。發(fā)酵條件:500mL三角瓶裝液量100mL,接種量10%,30℃200r/min振蕩培養(yǎng)。1.2.2過氧化物酶3mL溶液A(4-氨基-安替比林,1mmol/L;苯酚,6mmol/L;疊氮鈉,0.2g/L;過氧化物酶,5000U/L;磷酸鉀緩沖液,25mmol/L,pH7.5),150μm溶液B(膽固醇,8.26mg/mL;TritonX-100,4.26%;異丙醇為溶劑),50μL酶液,37℃,反應(yīng)5min,沸水浴3min,于500nm測吸光值。酶活(U/mL)=1.6832×OD1.2.3獨(dú)立培養(yǎng)條件出發(fā)菌株經(jīng)完全培養(yǎng)基連續(xù)兩次平皿活化,接種至50mL種子培養(yǎng)基,30℃200r/min,培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約14h),5000r/min離心10min,收集菌體,pH6.0的磷酸緩沖液稀釋至原體積,振蕩,同條件離心,反復(fù)重復(fù)2次,制成單細(xì)胞菌懸液。1.2.4超聲間隙處理取出發(fā)菌懸液5mL置于無菌玻璃試管內(nèi),處理條件為:冰水浴,亞硝基胍濃度為1mg/mL,超聲200W,50kHz,超聲間隙處理9次,每次處理5min,其間停3min。誘變結(jié)束后,采用5000r/min,離心10min,收集菌體,并用pH7.0的磷酸緩沖液稀釋至原體積,振蕩,同條件離心,反復(fù)重復(fù)2次,除去亞硝基胍。1.2.5超聲處理緩沖液制備取發(fā)酵液100mL,5000r/min離心10min取菌體,菌體懸浮于30mLpH7.0,0.05mol/L磷酸鉀緩沖液,超聲處理(200W,50kHz,間歇處理,每次5min,其間停1min)。超聲4次后,8000r/min離心取上清,加入20mL甲醇振蕩均勻,靜置2h,8000r/min離心10min,取上清,水浴蒸干,溶解于50mL甲醇溶液,8000r/min離心10min,取上清。2結(jié)果與分析2.1實驗2:單次實驗結(jié)果采用亞硝基胍和超聲波聯(lián)合處理以致死率為考察指標(biāo),復(fù)合誘變中超聲波處理總時間分別為5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min,實驗結(jié)果見表1。當(dāng)亞硝基胍濃度為1mg/mL,超聲處理35min,致死率為90%,故確定復(fù)合誘變的條件為亞硝基胍1mg/mL,200W50kHz超聲強(qiáng)度,處理35min。2.2突變株的生理生化鑒定通過篩選得到的菌株與出發(fā)菌株相比,菌落形態(tài)特征有了很大變化。出發(fā)菌株生長前期為乳白色菌落,邊緣整齊,表面光滑、潮濕,后期顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色。25#突變株生長期均為桔紅色,菌落邊緣整齊,表面光滑、潮濕(如圖1,圖2)。為鑒定其突變類型選擇了部分特征培養(yǎng)基進(jìn)行生理生化鑒定,實驗證明與出發(fā)菌株相比,突變株的生理生化特征沒有明顯變化,目前可以確定其突變?yōu)楫a(chǎn)酶提高型和菌落顏色變化的形態(tài)突變型,將此突變株命名為DGCCN-25。該突變株經(jīng)過8次傳代接種后,每次發(fā)酵水平相差不大,菌種顏色無變化都為桔紅色,故可以得出結(jié)論,該菌種遺傳穩(wěn)定性較穩(wěn)定,不會發(fā)生自發(fā)回復(fù)突變(表2)。2.3gccd-77對菌株產(chǎn)酶的影響從圖3中可以看出突變株DGCCN-25與出發(fā)菌株DGCDC-82相比,產(chǎn)酶高峰提前約6h,產(chǎn)酶能力提高約140%,這表明誘變菌株的產(chǎn)酶特性發(fā)生改變,產(chǎn)COD活力提高,利用膽固醇的效率提高。2.4蛋白吸收峰的確定如圖4所示,紅色素在280nm和450nm均有吸收峰,但280nm是蛋白的特殊吸收峰不能排除是雜質(zhì)蛋白,又因為物質(zhì)呈桔紅色,根據(jù)資料2.5膽哌-4-烯-3-酮與膽哌-4-烯-3-酮的關(guān)系從圖5中可以看出,隨著發(fā)酵時間的延長,COD酶活與紅色物質(zhì)的含量成偶聯(lián)正比關(guān)系。膽甾-4-烯-3-酮是COD分解膽固醇的產(chǎn)物,如圖6顯示,紅色素含量與膽甾-4-烯-3-酮含量成負(fù)相關(guān),這可能是因為COD分解膽固醇的產(chǎn)物膽甾-4-烯-3-酮在代謝流上趨于紅色素的合成方向,膽甾-4-烯-3-酮可能是紅色素的前提物質(zhì)。2.6回復(fù)突變株的產(chǎn)酶能力用與誘變相同的方法對突變株DGCCN-25進(jìn)行回復(fù)突變,得到2株回復(fù)突變株(如圖7,圖8)。從圖9中可以看出,回復(fù)突變株1,2的產(chǎn)酶能力明顯降低。紅色菌株發(fā)酵在約35h達(dá)到最高酶活1.24U/mL;粉色菌株發(fā)酵在約24h達(dá)到最高酶活為0.69U/mL;白色菌株發(fā)酵在約24h達(dá)到最高酶活0.17U/mL。以上結(jié)果反面證明了膽固醇氧化酶與紅色素之間的正相關(guān)偶聯(lián)關(guān)系,紅色素的含量越多酶活越高紅色素的含量越少酶活也越低。此特征可以作為高產(chǎn)菌種的篩選方法。3產(chǎn)酶能力結(jié)果的比較盡管基因工程技術(shù)已開始用于工業(yè)生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)菌株構(gòu)建,但傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變因子,如紫外線、低能離子、亞硝基胍等仍為遺傳育種不可或缺的手段。傳統(tǒng)的誘變育種在向更高效的方向發(fā)展主要集中在采用更有效的誘變手段和建立簡單、準(zhǔn)確、高效的篩子上。本實驗將超聲波與亞硝基胍兩種傳統(tǒng)的誘變手段結(jié)合起來,同時處理出發(fā)菌株取得了較好的誘變效果,獲得1株產(chǎn)酶活力提高140%的紅色突變株。又用相同的方法對突變株進(jìn)行處理,得到2株回復(fù)突變株。這2株回復(fù)突變株在顏色變淡的同時,產(chǎn)酶能力也在降低。相對于紅色突變株,白色回復(fù)突變株產(chǎn)酶活力降低了80%,淡粉色回復(fù)突變株產(chǎn)酶活力減低了44%。比色法證明在發(fā)酵過程中紅色素的含量與COD的酶活成正比偶聯(lián)關(guān)系,COD分解膽固醇產(chǎn)物膽甾-4-烯-3