利用納米技術(shù)快速檢測食源性致病菌的研究

快速檢測食源性致病菌的研究上海市延安中學(xué)黃逸男(個人項目)二零一零年一月是九十年代四大食源性致病菌中重要的兩種食源性致病菌。食用了被污染的本課題采用先進(jìn)的IMS/PCR方法，利用抗李斯特菌免疫磁性分離技術(shù)素(stx1)和Ⅱ型志賀毒素(stx2)、eaeA基因(粘附因子)和hlyA基因(溶血師及上海市疾病預(yù)防控制中心的許學(xué)斌老師的幫助下，利用課余及假期時間獨立完成的，在此我對曾經(jīng)幫助輔導(dǎo)過我的老師表示衷心的感謝。本課題分以下幾個階段完成：1.查閱并完成有關(guān)方法資料的收集整理，設(shè)計實驗方案。2.查閱文獻(xiàn)并設(shè)計特異性引物；3.確定復(fù)合PCR反應(yīng)體系的條件；4.進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌株的驗證工作，包括標(biāo)準(zhǔn)菌株及革蘭氏陽性和革蘭氏陰性標(biāo)準(zhǔn)菌牛肉、蔬菜和生的冷凍點心等，分別用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法、IMS/PCR方法作平行實驗，陽性結(jié)果通過API方法確證，獲得檢驗結(jié)果，并統(tǒng)計傳統(tǒng)方法與本方6.科研工作總結(jié)，論文撰寫，成果查新。查新結(jié)論：該項目的研究具有國內(nèi)外新穎性。五、推廣應(yīng)用及社會經(jīng)濟(jì)效益分析本方法采用納米技術(shù)，運(yùn)用IMS/PCR聯(lián)用方法最大程度的提高該致病菌的檢出率和靈敏度，其靈敏度達(dá)到5CFU/mL。最大優(yōu)點是少量、快速、經(jīng)濟(jì)。在5小時能夠檢出LMO和大腸桿菌0157?？朔Ｒ?guī)方法耗時長、繁瑣及不夠精確的缺點。此方法建立后，可與經(jīng)典常規(guī)方法互補(bǔ)，在分子生物學(xué)水平上對單增李斯特菌和大腸桿菌O157等食源性致病菌進(jìn)行檢測，預(yù)計將在食品安全的快速檢測部門、食品工業(yè)部門及衛(wèi)生監(jiān)控部門具有較廣的應(yīng)用前景，同時對2010年世博會的食品安全檢測技術(shù)將起到積極的作用。有一定的經(jīng)濟(jì)和社會效益。1.實驗菌株本實驗所用標(biāo)準(zhǔn)菌株共16株。菌種均來自輔導(dǎo)實驗室菌種庫的菌株。表1本實驗所用菌種..ATCC35967ATCC35897大腸桿菌0157:H7ATCC51816ATCC49214E.coli01574-92*2.主要生化試劑AntiListeriaantibodycoatedbeadsnmmLDynalOsloNor晶美生物工程制品有限公司(代理商)。Antiantibodycoatedbeads北京安普生物有限公司(代理商)。上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合2.4吐溫-20:上?；瘜W(xué)試劑公司。2.5葡萄糖：上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠。2.7氯化鈉：上?；瘜W(xué)試劑有限公司。2.9李斯特菌選擇性牛津平板:Merck,Germany。2.11科瑪嘉0157顯色培養(yǎng)基(CHRMagar):鄭州博賽生物工程有限責(zé)任2.15Taq聚合酶：寶生物工程(大連)有限公司。2.16PCR緩沖液(Mg2+):寶生物工程(大連)有限公司。2.17dNTP混合液：寶生物工程(大連)有限公司。2.18DL2000DNA分子量標(biāo)記：寶生物工程(大連)有限公司。2.19EDTA:上?；瘜W(xué)試劑有限公司。2.20瓊脂糖：上海華舜生物工程有限公司。UNIQ-10柱式基因組DNA小量抽提試劑盒：上海生工生物工程制品有限公司。API(CH20)生物鑒定試劑盒：法國梅利埃生物有限公司。VIDAS試劑條：法國梅利埃生物有限公司。4.1全自動熒光酶檢系統(tǒng)(Mini-Vidas):法國梅利埃生物有限公司。4.4高速冷凍離心機(jī)。4.5恒溫?fù)u床。4.6電泳儀：美國公司。4.7凝膠成像分析系統(tǒng)：美國公司。在800mL蒸餾水中溶解8gNaCl;0.2gKCl;1.44gNa?HPOgKHPO調(diào)節(jié)pH值到7.4,加水定容至1L,在1.034×10?Pa滅菌20分鐘。保存于室溫。5.3李斯特菌選擇性牛津平板加29.25g干粉至500mL蒸餾水中，于121℃,15分鐘滅菌。用5mL的1:1乙醇和無菌水溶解選擇性添加劑?；靹蚝蠹尤?0℃左右瓊脂中，然后倒平5.4洗滌緩沖液原液(0.1molL):28.75gNa2HPO?12H?O;2.72gKH?PO?加入1000mLH?O,工作洗滌緩沖液(0.01mol/L):90mL生理鹽水；10mLPBS原液；1滴吐溫20,現(xiàn)用現(xiàn)配。5.5出血性大腸桿菌0157增菌液(EC)新生霉素mEC培養(yǎng)基：在1L蒸餾水中溶解20g蛋白胨、1.12g膽鹽、5.0g6.9±0.1;于121℃,15分鐘高壓滅菌備用，用時加入1%新生霉素溶液。EB增菌液：在1L蒸餾水中溶解17g胰酪胨、3.0g膽鹽植物蛋白胨、5.0g蛋于121℃,15分鐘高壓滅菌備用。5.70157科瑪嘉平板每2.9g干粉溶于100mL蒸餾水中，加熱至100℃,不斷攪拌。如果用高壓滅菌器，不要加壓，加熱不能超過100℃,混合物液可以在微波爐內(nèi)加熱，煮全溶解。水浴冷卻至48℃,如果需要選擇性更強(qiáng)的培養(yǎng)基須加入碲酸鉀溶液，培養(yǎng)基在室溫可保存一天，或在4℃冰箱內(nèi)貯存數(shù)天(避光)。菌落色彩初篩微生物紫紅色大腸桿菌0157*大腸菌群無色至灰色變形桿菌等1.1嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)程稱取25g樣品，放于225mLEB/EC肉湯中30℃/37℃培養(yǎng)24小時之后，(LMO)取1mL增菌液接種于10mL的李斯特菌增菌肉湯，30℃培養(yǎng)24小時。觀察肉湯是否變黑。1.2以無菌方式吸取變黑2~3mL的李斯特菌增菌和O157增菌肉湯，在100℃水浴中加熱15小時，取出500μL煮沸滅活的增菌肉湯加入LMO/0157VIDAS試劑條的樣品孔內(nèi)，根據(jù)VIDAS操作規(guī)程檢測。若VIDAS的結(jié)果為陰性，則可判定樣品為陰性；如果VIDAS的結(jié)果得出是陽性，則需要對該陽性可疑樣品進(jìn)行鑒定。1.3對于VIDAS陽性結(jié)果的樣品，需劃線分離至牛津平板/柯瑪嘉顯色選擇平板上，37℃24小時培養(yǎng)，觀察菌落特征。1.4.1(LMO)挑取牛津平板上小的，灰色的可疑菌落，用API作進(jìn)一步鑒定。按照APIListeria鑒定卡的操作規(guī)程對典型的菌落進(jìn)行接種，經(jīng)過35℃~37℃,18~24小時培養(yǎng)，讀取結(jié)果。1.4.2(0157)挑取在柯瑪嘉顯色平板上，呈紫紅色菌落。作進(jìn)一步血清列酶聯(lián)反應(yīng)，免疫捕獲、洗滌、標(biāo)記物和底物反應(yīng)、熒光分析，45分鐘3.21麥?zhǔn)媳葷?00μL加至特定管中，0.5麥?zhǔn)媳葷?0μL加至以后9個管3.335～37℃,培養(yǎng)18～24小時。3.4加一滴染液至特定的孔中，3分鐘。4.1在25g樣品中，加入1%加酶蛋白胨水50mL至樣品袋中，拍打20分4.2將上層清液輕輕倒入50mL離心管中，5000rpm離心2分鐘。4.3將上層清液倒入另一個50mL離心管中，5000rpm離心20分鐘。4.4將上層清液倒出，加入700μLPBS/0.1%吐溫20,將管壁沉淀懸浮，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。4.5在離心管中加入20μL包被單增李斯特菌抗體或大腸桿菌0157的免疫beads),緩慢顛倒180°振搖10分鐘。4.6將離心管放至磁性架上，靜至10分鐘。4.7慢慢吸去上清液。4.8加入200μLTE懸浮磁珠。4.9按5方法提取DNA。4.10PCR檢測。5.1收集待測菌體，用200μLTE懸浮。5.2加入400μL消化液，混勻；加入10μL蛋白酶K(10mg/mL),混勻，55℃保溫5分鐘。5.3加入200μL無水乙醇，混勻，然后將樣品全部轉(zhuǎn)移到UNIQ-10柱。5.410,000rpm,室溫離心1分鐘。5.5棄去離心管中的廢液。將柱子放回同一根離心管中，加入500μL洗液，10,000rpm,室溫離心1分鐘。5.6重復(fù)步驟5.5一次。5.7取下UNIQ-10柱，棄去離心管中的全部廢液。將柱子放回同一根離心管中，10,000rpm,室溫離心1分鐘。5.8在柱子中央加入100μLElutionBuffer,將柱子放入新的干凈1.5mL或2.0mL離心管中。5.910,000rpm,室溫離心1分鐘。即為基因組DNA。根據(jù)用途，-20℃保存。IMS/PCR檢測方法程序如下：食品樣品(25g)加入0.1%的蛋白胨水50mL拍打20分鐘5000rpm,離心2分鐘5000rpm,離心20分鐘試劑盒抽提DNA6.1DNA抽提同5方法。引物作用對象順序序列長度(bp)引物序列(5'--3')序列長度hlyA-RAATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT6.3.20157反應(yīng)體系引物hly-RTaq酶(100U)5分鐘1分鐘1分鐘40個循環(huán)1分鐘延伸8分鐘94℃7分鐘最后72℃延伸5分鐘。取20μLPCR產(chǎn)物，加2μL10x上樣緩沖液點樣進(jìn)行電泳。PCR產(chǎn)物電泳檢測所用的凝膠濃度為2.0%。120V,電泳1小時。7.靈敏度實驗7.1待用樣品(肉糜)121℃,20分鐘滅菌，冷凍過夜。7.2稱取7.1所得的樣品25g至無菌均質(zhì)袋中，每個樣品各2份，另加陽性對照2小時，細(xì)菌數(shù)為5×10?,用無菌重蒸水做10倍遞增稀釋液10?1-107。7.4將7.3制得的菌液分別加至7.2樣品中1mL,一份樣品加入225mLEB增菌液或EC增菌液中，30℃培養(yǎng)24小時，分別吸取10μL、100μL菌液，分別劃血平板，37℃培養(yǎng)24小時，計數(shù)。7.5另一份樣品振搖后，然后按照免疫磁珠吸附法操作，電泳結(jié)果與計數(shù)結(jié)果對照，顯示其靈敏度。8.食品檢驗及經(jīng)典方法驗證肉湯中，30℃/37℃,24小時增菌，用IMS/PCR方法進(jìn)行單增李斯特菌和大腸桿菌0157檢驗，同時用傳統(tǒng)經(jīng)典方法作平行實驗，對陽性菌株作API確證。9.單增李斯特菌和大腸桿菌0157檢測平行試驗：拍打20分鐘37℃24小時37℃24h+API20E37℃,24小時1.對引物設(shè)計的驗證提取標(biāo)準(zhǔn)菌株LMOATCC7644DNA,分別加入上面設(shè)計的特異性兩對引物進(jìn)行PCR,結(jié)果如下。1.DL2000分子量；2.兩對引物；3.陰性對照；4.陰性對照；5.一對引物引物和一對特異性引物及不用引物進(jìn)行多重PCR,結(jié)果和實際符合。二對引物用標(biāo)準(zhǔn)菌株16株，其中單增李斯特菌2株，李斯特菌屬5株，01575株，G*及G菌各2株。見表4。菌種名稱單核細(xì)胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes屬種(血清)++單核細(xì)胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes++++格氏李斯特菌Listeriagrayii+斯氏李斯特菌Listeriaseeligeri+韋爾希默氏李斯特菌Listeriawelshimeri+金黃色葡萄球菌Staphylococusaureus腸炎沙門氏菌Salmonellaenteritidis出血性大腸桿菌E.coliO157:H?埃希氏大腸菌EscherichiaColiE.coli0157++Ecoli0157十十E.coli0157十十從表4中可看出，復(fù)合PCR結(jié)果顯示出本實驗所設(shè)計的特異性引物正確，和標(biāo)準(zhǔn)菌株的結(jié)果完全符合。PCR確證如圖2、圖3。圖2:單增李斯特菌、李斯特菌屬及陰性菌株比較圖3:0157不同種PCR電泳結(jié)果3.食品檢驗及經(jīng)典方法驗證結(jié)果我們對從超市及農(nóng)貿(mào)市場購買的的200個樣品進(jìn)行IMS/PCR和經(jīng)典方法的驗證，結(jié)果，符合率為100%。具體列表如下：表5實際樣品中單增李斯特菌和大腸桿菌O157檢測結(jié)果N(樣品數(shù))IMS/PCR法陽性數(shù)API確證陽性數(shù)0000蔬菜111雞肉0000冷凍點心777777牛肉622220000豬肉41100000000總計從上表中可看出，單增李斯特菌陽性檢出率排序分別為牛肉33%、冷凍點心30.4%、豬肉25%、豬肉糜16%和新鮮蔬菜4.3%。0157未檢出。同時也提醒我們在食用以上幾種產(chǎn)品時，一定要注意加熱后再食用，避免生食。4.模擬樣品檢測的敏感性實驗數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)菌株LMOATCC7644或O157ATCC43889,接營養(yǎng)菌株可檢出的最低稀釋度細(xì)菌接種量敏感度(CFU/mL)55對照5.陰性對照6.10'稀釋度(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7644濃度)7.102稀釋度8.103稀從上面PCR結(jié)果看到，10-5稀釋度為其檢測低限，其對應(yīng)的菌落計數(shù)為5CFU/mL。桿菌0157菌株。的血清型，但是多克隆抗體并不能區(qū)分致病性、非致病性李斯特菌和E.coli0157,也不能區(qū)分李斯特菌屬內(nèi)和E.coli0157屬內(nèi)的各種菌。因此，單獨用免0157的DNA,因此免疫磁珠吸附的與李斯特菌有交叉抗原的非LMO或大腸桿菌0157菌及其它雜菌，不會干擾PCR的結(jié)果。因此，性的檢測LMO或大腸桿菌0157,敏感度高?？稍?h內(nèi)完成檢測，且檢測結(jié)果和PCR反應(yīng)是在經(jīng)體外擴(kuò)增目的基因或特定DNA片段的一種十分有效的技術(shù)，復(fù)合PCR反應(yīng)中應(yīng)用的二對或多對核酸引物，其