磁性微球?yàn)楣滔嗷|(zhì)的藥物-蛋白結(jié)合常數(shù)的測(cè)定

磁性微球?yàn)楣滔嗷|(zhì)的藥物-蛋白結(jié)合常數(shù)的測(cè)定

通常，藥物會(huì)通過(guò)血漿儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)竭_(dá)活性部位的藥理。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白,藥物與白蛋白之間的作用,影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄,從而影響藥物的作用強(qiáng)度和時(shí)間。因此,藥物與白蛋白相互作用的研究無(wú)論對(duì)于新藥研發(fā)還是指導(dǎo)臨床合理用藥都具有重要意義常用的研究藥物與白蛋白相互作用的方法有平衡透析法、超濾法、紫外-可見(jiàn)吸收光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法以及親和色譜法和核磁共振法等近年來(lái),磁性微球在生物化學(xué)和生物技術(shù)學(xué)方面的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。用修飾蛋白的磁性微球研究藥物與蛋白的相互作用,通過(guò)測(cè)定游離的藥物濃度,計(jì)算藥物與蛋白的結(jié)合常數(shù),這種方法高效、快速1實(shí)驗(yàn)部分1.1n-羥基德國(guó)回復(fù)突變/二醛質(zhì)、酰氯-內(nèi)酰胺nhs、吡啶、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)的研究牛血清白蛋白,分子生物學(xué)級(jí),純度98%;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛(純度50%)、吡啶、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)G250均為分析純;布洛芬、色氨酸、羅氟司特、安立生坦、瑞替加濱均為醫(yī)藥級(jí);表面氨基化的四氧化三鐵磁性微球(Fe島津高效液相色譜儀(包括LC-600恒流泵,SPD-6AV紫外檢測(cè)器和N2000色譜工作站);島津UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);C1.2bsa覆蓋磁性微球的制備分別采用EDC/NHS和戊二醛作為偶聯(lián)劑,將BSA偶聯(lián)至氨基修飾的磁性微球上。1.2.1edc/nhs法100mg磁性微球分散于2mL磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖鹽,10mmol/L,pH7.4)中,加入50mgEDC,25mgNHS和適量BSA,室溫振蕩反應(yīng)2h。磁分離,保留上清,磁性微球用PBS洗滌3次。1.2.2磁性微球的制備100mg磁性微球用吡啶緩沖液(10mmol/L,pH5.5)洗滌后,分散于2mL含5%戊二醛的吡啶緩沖液中,37℃反應(yīng)5h。用吡啶緩沖液洗滌磁性微球3次;再將磁性微球分散于2mL吡啶緩沖液中,加入適量BSA,37℃反應(yīng)16h。磁分離,收集上清,磁性微球加入1mL甘氨酸終止液(1mol/L,pH8.0),于37℃反應(yīng)1h,用PBS溶液洗滌3次。1.3b洛芬與b-bsa的相互作用1.3.1布洛芬的高效液相色譜法在1.5mL的離心管中,加入200μLMB-BSA(50mg/mL)和200μL布洛芬(10μmol/L),37℃振蕩反應(yīng)不同時(shí)間,磁分離,上清用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)布洛芬的濃度。1.3.2布洛芬含量測(cè)定布洛芬與MB-BSA作用后,收集上清,用HPLC檢測(cè)布洛芬的含量;用洗脫液將布洛芬洗脫后,將MB-BSA再次與布洛芬作用,如此重復(fù)6次。1.3.3布洛芬濃度的檢測(cè)將布洛芬用PBS緩沖鹽溶解并稀釋至不同濃度(1.0~40.0μmol/L)。在1.5mL的離心管中加入200μLMB-BSA(50mg/mL)和200μL一系列不同濃度的布洛芬,37℃振蕩反應(yīng),磁分離,上清用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)布洛芬的濃度,通過(guò)羅森塔爾方程1.4藥物與b-bsa的結(jié)合步驟同1.5.2節(jié),測(cè)定色氨酸、安立生坦、瑞替加濱和羅氟司特4種藥物與BSA的結(jié)合常數(shù)。1.5分析1.5.1蛋白鍵合量的測(cè)定采用Bradford蛋白定量法,通過(guò)考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白的顯色反應(yīng),測(cè)定鍵合前后上清液中的蛋白含量的變化,計(jì)算磁性微球上BSA的鍵合量。1.5.2布洛芬的含量是由此數(shù)據(jù)測(cè)定的HPLC檢測(cè)條件C1.5.3四種藥物的含量是由降低的1.5.3.1-氨酸1.5.3.2.安全1.5.3.3.瑞利加斌1.5.3.4-rofos2結(jié)果與討論2.1是否應(yīng)當(dāng)保證盡量低的非特異性吸附?藥物與BSA結(jié)合的同時(shí),也會(huì)在載體磁性微球上產(chǎn)生非特異性吸附。磁性微球?qū)λ幬锏姆翘禺愋晕皆礁?藥物與BSA之間的特異性吸附越不明顯,實(shí)驗(yàn)誤差就越大。因此,應(yīng)當(dāng)保證盡量低的非特異性吸附。對(duì)幾種常用的商品化的磁性微球———UF-MB、PS-MB和Fe由圖1可知,UF-MB和PS-MB對(duì)布洛芬和色氨酸的非特異性吸附較低,而對(duì)瑞替加濱的非特異性吸附較明顯;Fe2.2微球上的氨基EDC與NHS聯(lián)合使用,與蛋白上的羧基反應(yīng),形成活性中間體,該活性中間體與磁性微球上的氨基脫水形成酰胺鍵。戊二醛則是通過(guò)分子兩端的醛基分別與蛋白和磁性微球上的氨基形成亞胺,從而將蛋白固定于微球上,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,當(dāng)BSA加入量較少時(shí),蛋白鍵合量較低,但體系中BSA幾乎完全與磁球偶聯(lián),蛋白利用率接近100%;隨著BSA用量的增加,蛋白鍵合量隨之增加,而蛋白利用率也隨之降低;當(dāng)BSA與磁性微球的質(zhì)量比達(dá)到100μg/mg左右時(shí),鍵合量達(dá)到飽和,不再增加。EDC法的蛋白最大鍵合量為44μg/mg,蛋白利用率為44%;戊二醛法的最大鍵合量為49μg/mg,蛋白利用率為49%。兩種方法均比報(bào)道顯著提高2.3iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia藥物分子的關(guān)系BSA的晶體結(jié)構(gòu)有3個(gè)類似的結(jié)構(gòu)域:I、II、III,每個(gè)結(jié)構(gòu)域有2個(gè)亞域結(jié)構(gòu)A和B,這些亞域結(jié)構(gòu)被命名為IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB,而藥物分子主要結(jié)合在亞域結(jié)構(gòu)IIA和IIIA,其中,IIIA中的結(jié)合空腔最活躍,布洛芬、色氨酸等藥物是在結(jié)構(gòu)域IIIA結(jié)合的典型藥物2.3.1mb-bsa對(duì)布洛芬的吸附時(shí)間對(duì)結(jié)合量的影響布洛芬與空白磁性微球和BSA包覆的磁性微球作用前后的上清液色譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,BSA包覆的磁性微球?qū)Σ悸宸揖哂忻黠@的吸附作用,而空白磁性微球?qū)Σ悸宸規(guī)缀鯖](méi)有吸附作用。以布洛芬為模型藥物,考察了MB-BSA與藥物的作用時(shí)間對(duì)結(jié)合量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,布洛芬在20min之前與MB-BSA迅速作用,并在20min達(dá)到吸附平衡。因此,固定MB-BSA與藥物的作用時(shí)間為20min。2.3.2洗脫溶劑對(duì)mb-bsa的吸附以布洛芬為模型藥物,研究藥物與BSA的相互作用模式,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,不洗脫時(shí),隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加,MB-BSA對(duì)布洛芬的結(jié)合量逐漸降低,在第4次利用時(shí),吸附量幾乎為零,說(shuō)明此時(shí)MB-BSA對(duì)布洛芬的吸附達(dá)到了飽和。用純甲醇洗脫后,MB-BSA對(duì)布洛芬的吸附量幾乎沒(méi)有變化;用緩沖鹽洗脫后,MB-BSA對(duì)布洛芬的相對(duì)吸附量約為80%。這說(shuō)明BSA與布洛芬之間存在疏水作用力和靜電作用力,其中疏水作用力占主導(dǎo)。當(dāng)用甲醇作為洗脫劑時(shí),甲醇破壞了BSA與布洛芬之間的疏水作用力,布洛芬從BSA上完全解吸附;緩沖鹽破壞了BSA與布洛芬之間的靜電作用,而疏水作用力仍存在,因此,布洛芬從BSA上部分解吸附。另一方面,用甲醇作為洗脫劑并不影響MB-BSA的重復(fù)利用,與文獻(xiàn)中有機(jī)溶劑會(huì)影響B(tài)SA活性的報(bào)道2.3.3布洛芬與bsa的結(jié)合常數(shù)藥物與蛋白的作用是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,用S代表蛋白上的位點(diǎn),D代表藥物小分子,D當(dāng)藥物與蛋白的作用達(dá)到平衡時(shí),藥物與蛋白的結(jié)合常數(shù)K假設(shè)蛋白上所有活性位點(diǎn)的濃度為B[D圖6和圖7分別為布洛芬在MB-BSA上的飽和吸附曲線及羅森塔爾曲線?？梢杂?jì)算布洛芬的K2.4藥物對(duì)羅森塔爾曲線的影響各藥物在MB-BSA上的飽和吸附曲線圖,結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知,隨著藥物濃度的增加,吸附量隨之增加并趨于飽和。不同藥物的羅森塔爾曲線圖,結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知,色氨酸及3類新藥安立生坦、瑞替加濱、羅氟司特與BSA的結(jié)合常數(shù)與布洛芬的結(jié)合常數(shù)均在一個(gè)數(shù)量級(jí)上。3流動(dòng)相5/40m建立了一種用B