不同測(cè)定方法測(cè)定雨生紅球藻內(nèi)蝦青素的比較

不同測(cè)定方法測(cè)定雨生紅球藻內(nèi)蝦青素的比較

蝦青素（3，3'二羥基-萘，4，4'二羥基色胺）是一種非維生素a的酮類(lèi)化合物。雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種單細(xì)胞微藻,隸屬綠藻門(mén)、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬.由于該藻能大量累積蝦青素而呈現(xiàn)紅色,故取名紅球藻.雨生紅球藻是自然界天然蝦青素含量最高的生物,含量達(dá)到干細(xì)胞的2%~4%目前實(shí)驗(yàn)室的蝦青素測(cè)定方法很多,提取時(shí)間、提取溶劑、測(cè)定方法等都有所不同,而各生產(chǎn)蝦青素公司也有不同的測(cè)定方法.目前采用的蝦青素測(cè)定方法主要有高效液相色譜測(cè)定法(HPLC)和分光光度測(cè)定法,而我們采用實(shí)驗(yàn)室自己建立的高效液相色譜法與荊州天然蝦青素有限公司的方法1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料藻粉為Cyanotech公司購(gòu)買(mǎi)的雨生紅球藻粉(細(xì)胞已破壁),蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司.1.2超聲波清洗儀UV-7504紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司);TP300超聲波清洗儀(天鵬電子新技術(shù)有限公司);飛鴿TDL80-2B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW-80A渦旋攪拌器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司);高效液相色譜儀(Waters公司).1.3方法所有藻粉均加液氮后用研缽研磨5min進(jìn)行細(xì)胞破壁.1.3.1dmso吸光度測(cè)定精確稱(chēng)取藻粉20mg,置于10mL玻璃離心管,加入5mL含5%NaOH、30%甲醇的水溶液,70℃水浴5min,保溫過(guò)程中經(jīng)常搖動(dòng).3000rpm離心3min,然后去上清液(葉綠素被抽提到上清液中,并被強(qiáng)堿破壞),藻渣備用.離心管中加入3mL含有少量醋酸(5滴10mL)的DMSO(二甲基亞砜),搖勻,70℃保溫5min,保溫過(guò)程中要不斷搖動(dòng)離心管.3000rpm離心3min,將上清液移入10mL容量瓶,重復(fù)至少3次,使剩余離心管底部的藻渣無(wú)顏色或很淺的顏色.將1次或幾次收集的上清液用DMSO精確定容至10mL,取1mL放入另1個(gè)10mL容量瓶中,用DMSO精確定容至10mL.將待測(cè)溶液放入1cm光徑比色皿中,在492nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ),DMSO作空白對(duì)照.(2)計(jì)算公共格式溶液中蝦青素的濃度(mg·mL藻粉中蝦青素的含量:1.3.2樣品的制備和稀釋稱(chēng)取25mg干燥藻粉,放入10mL離心管中,加3g石英砂.在離心管中加入5mLDMSO,45~50℃水浴30min,每10min渦旋振蕩15s(共計(jì)3次).3000rpm離心5min使細(xì)胞物質(zhì)沉淀,將上清液轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中.再往離心管中加入5mL丙酮,渦旋振蕩30s,3000rpm離心5min使細(xì)胞物質(zhì)沉淀,將上清液轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中,丙酮抽提至少3次,直至上清液基本無(wú)色(吸光值小于0.05).用丙酮定容至25mL,蓋上容量瓶,輕微振蕩混合,吸取5~7mL放入離心管,再次3000rpm離心以除去前面步驟中帶入的顆粒物.在474nm波長(zhǎng)下測(cè)定最大吸光值,丙酮作空白對(duì)照.如果吸光值大于1.25,則必須對(duì)樣品用丙酮稀釋后再測(cè),稀釋倍數(shù)一般為1:7.(2)計(jì)算公共格式1.3.3葉綠素含量的測(cè)定取10mg干燥的藻粉,加入到10mL離心管中,再在離心管中加入5mL的5%KOH、30%甲醇的混合溶液,50℃下處理15min,以去除葉綠素.用蒸餾水洗2次,3000rpm離心,然后去除上清液.在去除上清液后的藻渣中加5mL氯仿:乙醇(v/v=1:1)的混合溶液,40℃下水浴45min,保溫過(guò)程中要經(jīng)常振蕩.然后3000rpm離心5min,取上清液.再用氯仿:乙醇的混合溶液定容至10mL容量瓶中.輕微振蕩混勻,再在487nm下測(cè)定最大吸光值.如果吸光值過(guò)高,可適當(dāng)稀釋5倍后再測(cè).(2)計(jì)算公共格式1.3.4方法的檢出限和測(cè)定波長(zhǎng)Nova-PakC18色譜柱(150mm×3.9mm,5μm,美國(guó)Waters公司);流動(dòng)相A為水,流動(dòng)相B為甲醇;洗脫梯度:10%A,90%B(0min);10%A,90%B(1min);0%A,100%B(10min);0%A,100%B(20min).流速1mL·min(1)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇.雨生紅球藻中含有多種色素,其各種組分的吸收峰在300~670nm之間,游離蝦青素和蝦青素酯的吸收峰在470~480nm之間,因此分析選用檢測(cè)波長(zhǎng)為476nm.(2)用外標(biāo)峰面積法測(cè)定線性關(guān)系.準(zhǔn)確吸取一定體積的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制成6份質(zhì)量濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品,分別取10μL進(jìn)樣.由色譜工作站處理數(shù)據(jù),以蝦青素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo),繪制蝦青素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線.(3)精密度實(shí)驗(yàn).將一標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次,計(jì)算各組分的峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.(4)雨生紅球藻中蝦青素的提取.取10mg藻粉,加液氮后用研缽研磨5min進(jìn)行細(xì)胞破壁,加入3mL丙酮,渦旋震蕩15s,置50℃水浴30min,每隔10min震蕩15s,3500rpm離心10min,取上清液,再加入2mL丙酮,渦旋震蕩15s后再次離心,重復(fù)以上操作直到藻體變白色.將蝦青素丙酮提取液用氮?dú)獯蹈?用25mL甲醇定容后貯存于-20℃冰箱備用.2結(jié)果與討論2.1方法的精密度用外標(biāo)峰面積法測(cè)定結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)蝦青素HPLC圖譜如圖1所示,實(shí)驗(yàn)樣品提取得到的蝦青素的HPLC圖譜如圖2所示.由色譜工作站處理數(shù)據(jù),以蝦青素的質(zhì)量濃度=為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),得到蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖3所示,y=32202x+12122,R精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果:將一標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次,計(jì)算各組分的峰面積、保留時(shí)間及它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見(jiàn)表1.2.2提取試劑的參數(shù)比較從提取試劑、破壁方法、測(cè)定波長(zhǎng)和摩爾吸光系數(shù)4個(gè)方面進(jìn)行方法的參數(shù)比較,見(jiàn)表2.可看出:提取試劑都不同,測(cè)定波長(zhǎng)略有差別,而破壁方法除Cyanotech公司多加石英砂研磨,其他一樣.2.3采用hplc分析方法表3是采用4種方法得到的最終蝦青素的百分含量,可以看出,如果以HPLC定量分析的蝦青素含量作為標(biāo)準(zhǔn)參照,采用美國(guó)Cyanotech公司的分析方法得到的含量值為HPLC法的89%,而其他2種方法約為HPLC法的80%.2.4測(cè)定蝦青素含量差異的原因從表3中可以看到,在3種分光光度法中,美國(guó)Cyanotech公司的方法得到的蝦青素含量比其他2種要高,達(dá)到HPLC測(cè)得的89.2%,其他2種分別只達(dá)到了76.3%和80.4%.造成測(cè)定的蝦青素含量差異的原因主要是:(1)高效液相提取溶劑的選擇對(duì)于蝦青素的提取是非常重要的.荊州天然蝦青素有限公司的方法的提取試劑是二甲基椏楓(帶醋酸).二甲基亞砜能溶于乙醇,丙醇,苯和氯仿等大多數(shù)有機(jī)物,被譽(yù)為“萬(wàn)能溶劑”,廣泛用作溶劑和反應(yīng)試劑Cyanotech公司采用的是先用二甲基椏楓后丙酮提取,丙酮是許多物質(zhì)的良好溶劑.丙酮的極性較高,蝦青素的溶解度雖然較差,但是由于是親水性溶劑,易于滲透進(jìn)入細(xì)胞中,加上配合二甲基亞砜提取,有較高的提取效率.歐陽(yáng)琴等由于氯仿等溶劑親水性很差,溶劑不容易進(jìn)入細(xì)胞中,因此提取率不高(2)蝦青素的提取各種有機(jī)溶劑從雨生紅球藻細(xì)胞萃取蝦青素的原理是