度人教版DNA的粗提取與鑒定 市賽獲獎(jiǎng)

1.1DNA的粗提取與鑒定專題五DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)1.知識(shí)目標(biāo)理解DNA的理化特性及根據(jù)其理化特性而提取和鑒定的原理。2.能力目標(biāo)(1)初步掌握DNA的粗提取和鑒定的方法。(2)在對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、步驟的理解和分析過程中發(fā)展學(xué)生的科學(xué)思維。3.情感、態(tài)度、價(jià)值觀在科學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)比較細(xì)致、實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度。學(xué)習(xí)目標(biāo)

一、導(dǎo)入新課這節(jié)課,我們一起學(xué)習(xí)“DNA的粗提取與鑒定”技術(shù)。板書:DNA的粗提取與鑒定DNA的提取技術(shù)是整個(gè)基因工程技術(shù)基礎(chǔ)?；旧?不論是出于何種目的的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),大到被稱為“人類阿波羅計(jì)劃”的人類基因組計(jì)劃,小到今天已經(jīng)被我們熟知的親子鑒定,DNA提取技術(shù)都是其中基礎(chǔ)的基礎(chǔ)。而其他諸如RNA的提取,質(zhì)粒的提取等實(shí)驗(yàn),都可以說是參考這一技術(shù)改進(jìn),或者重新設(shè)計(jì)出來的。

1、選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。對(duì)于DNA的粗提取而言．就是要利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。二、提取原理DNA的粗提取與鑒定2．原理、方法和目的基本原理方法目的DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低溶于NaCl溶液中并稀釋①NaCl溶液為2mol/L時(shí)，DNA溶解，而部分蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析生成沉淀，通過過濾可除去部分蛋白質(zhì)及不溶于NaCl溶液的雜質(zhì)②當(dāng)NaCl溶液稀釋至0.14mol/L時(shí)，DNA析出，過濾可除去溶于NaCl溶液的部分蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)DNA不被蛋白酶所水解加入嫩肉粉嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白質(zhì)（酶的專一性）DNA不溶于酒精溶液加入冷卻酒精(95%)DNA析出，除去溶于酒精的蛋白質(zhì)DNA可被二苯胺染成藍(lán)色加入二苯胺，并沸水浴鑒定DNA高溫DNA耐高溫DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性不同：蛋白質(zhì)、DNA熱穩(wěn)定性不同。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。DNA對(duì)洗滌劑耐受性洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒有影響。加入洗滌劑51）不同濃度NaCl中DNA溶解度不同。

2）DNA與其他細(xì)胞成分在酒精中溶解度不同，DNA不溶于酒精，細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。3）DNA和蛋白質(zhì)對(duì)酶耐受性不同：酶的專一性——蛋白酶水解蛋白質(zhì)。但是對(duì)DNA沒有影響。4）DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性不同：蛋白質(zhì)、DNA熱穩(wěn)定性不同。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。5）DNA和蛋白質(zhì)對(duì)洗滌劑耐受性不同：洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒有影響。提取DNA的原理包括DNA的

兩個(gè)方面溶解性和耐受性3.DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)原理64.實(shí)驗(yàn)材料

①動(dòng)物

雞血細(xì)胞液的優(yōu)點(diǎn)提醒：人和哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞中不含細(xì)胞核，也沒有DNA，不適于作為DNA提取的材料，但卻是提取血紅蛋白的理想材料。

雞血紅細(xì)胞、白細(xì)胞中都有細(xì)胞核，含大量的DNA,既經(jīng)濟(jì)又易取

②植物：新鮮菜花、蒜黃、菠菜等。

7

DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。二、DNA的溶解性溶解度NaCl濃度0.14mol/L曲線解讀：1、在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；2、在0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最小；3、當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。

利用該特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離的目的。

DNA不溶于酒精，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步地分離。

粗提取提純

與DNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。

本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因：一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)。為什么用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料？能否選用牛、羊、馬血做實(shí)驗(yàn)材料？為什么？不能。因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中無細(xì)胞核，僅靠白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的少數(shù)DNA，在實(shí)驗(yàn)中很難提取到。三、以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取1、制備雞血細(xì)胞液2、破碎細(xì)胞，釋放DNA3、溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA4、DNA的析出——提取5、DNA的初步純化——提純6、DNA的鑒定提取DNA的具體步驟1、制備雞血細(xì)胞液

取質(zhì)量濃度為0.1g/mL的檸檬酸鈉溶液100mL，置于500

mL燒杯中，注入新鮮的雞血（約180mL），同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免血液凝結(jié)。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，靜置1d，使血細(xì)胞自行沉淀。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。

檸檬酸鈉可防止血液凝固2、破碎細(xì)胞，釋放DNA

向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水，并且攪拌，從而使血細(xì)胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細(xì)胞的破裂。注意應(yīng)沿一個(gè)方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。

釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應(yīng)用3～4層紗布進(jìn)行過濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)。

蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？

可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。3、溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA

在濃度較高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游離出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入兩倍體積的濃度為2mol/L的NaCl溶液，攪拌1min。注意應(yīng)沿一個(gè)方向攪拌，使DNA充分溶解。如果使用植物材料，必須研磨充分。

研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。4、DNA的析出——提取

將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞。同時(shí)應(yīng)注意控制加水量，使NaCl溶液的始終濃度為0.1～0.2

mol/L。加水太多、溶液過稀，會(huì)使DNA分子又重新溶解。為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？

1、用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；

2、用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。5、DNA的初步純化——提純

如果提取的DNA量不夠多且其中含有較多雜質(zhì)，或者加入溶液和攪拌等操作過程不規(guī)范，都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，常常使制取的DNA粗制品不能顯示出DNA的本色──白色。為了增進(jìn)實(shí)驗(yàn)效果，需要對(duì)DNA粗制品進(jìn)行簡(jiǎn)單的提純。6、DNA的鑒定

二苯胺法：紫外燈照射法：

用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液，將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹到蠟紙上，再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260nm)下照射(暗室中)，可呈現(xiàn)橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在260nm處)。電泳法：適合鑒定純度較高的DNA。DNA與二苯胺沸水浴呈現(xiàn)藍(lán)色。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。

提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。提取DNA的實(shí)驗(yàn)操作主要步驟的目的⑴過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液目的:獲得含核物質(zhì)的濾液

⑵過濾含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液目的:獲取紗布上的粘稠物

⑶過濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液目的:得到含DNA的濾液

本實(shí)驗(yàn)中有三次過濾,分別有什么作用?第一次攪拌加蒸餾水的雞血細(xì)胞液

加速細(xì)胞的破裂第二次攪拌加2mol/LNaCl溶液的濾液

使DNA與溶液混合均勻第三次攪拌加蒸餾水至0.14mol/LNaCl溶液

稀釋NaCl溶液,析出DNA第四次攪拌放入2mol/LNaCl溶液中紗布上的粘稠物

使DNA盡可能多的溶于溶液中第五次攪拌體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精

提取含雜質(zhì)較少的DNA實(shí)驗(yàn)中有五次用玻璃棒攪拌?分別有什么作用?DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)原理DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同DNA與其他細(xì)胞成分在酒精中溶解度不同DNA和蛋白質(zhì)對(duì)酶、高溫和洗滌劑耐受性不同DNA與二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)DNA粗提取選擇適宜材料破碎細(xì)胞DNA的溶解和析出DNA的純化鑒定DNA與二苯胺混合，沸水浴，呈現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)課堂總結(jié)：1、下列圖示中能反映DNA溶解度與NaCl溶液濃度(mol/L)之間的關(guān)系的是（）C0.14DNA溶解度0.140.140.14DNA溶解度DNA溶解度DNA溶解度ABCDNaCl濃度NaCl濃度NaCl濃度NaCl濃度25課堂練習(xí)：2、下列操作可以達(dá)到目的的選項(xiàng)是選項(xiàng)操作目的A溶解海藻酸鈉時(shí)用大火加熱海藻酸鈉可以快速溶解

B將裝有蛋白質(zhì)粗制品的透析袋（玻璃紙制成）放入透析液中

蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分離C在DNA粗提取實(shí)驗(yàn)中，雞血中加入蒸餾水稀釋血液，防止凝固D洋蔥根尖解離后漂洗使細(xì)胞分散，利于觀察B微火加熱并不斷攪拌，