曼陀羅種子萌發(fā)及組織培養(yǎng)條件優(yōu)化

曼陀羅種子萌發(fā)及組織培養(yǎng)條件優(yōu)化

曼陀羅是茄子科的一級草本植物。它也被稱為醉心花、狗堅果、洋金花、楓茄子、萬桃花等。具有抗風抗?jié)瘛⒅瓜?、定痛的功效，具有很高的藥用價值。其藥效成分主要為莨菪堿(hyoscyamine)、東莨菪堿(scopolamine)及阿托品(atropine)等托品烷類生物堿類,內(nèi)含的生物活性成分具有抗膽堿特性且活性較高,在醫(yī)學、戒毒、植保和環(huán)保領域都有廣泛的運用,對多種疾病有很好的治療作用。目前有關曼陀羅種子萌發(fā)和組織培養(yǎng)的研究,僅見用理化方法處理曼陀羅種子,打破其休眠而提高種子發(fā)芽率、愈傷組織分化及懸浮細胞再生、用愈傷組織制備原生質(zhì)體等方面。而利用GA3促進曼陀羅種子萌發(fā)的時間和濃度效應以及植株再生體系的建立未見系統(tǒng)報道。曼陀羅種子自然萌發(fā)率低,對季節(jié)和氣候要求高,建立曼陀羅種子萌發(fā)及植株再生體系,打破曼陀羅生長和繁殖的環(huán)境限制,為曼陀羅資源開發(fā)和市場需求提供重要的技術保證。1種子萌發(fā)、幼葉發(fā)育曼陀羅種子采于貴州省貴陽市藥用植物園,經(jīng)西南大學孫敏教授鑒定為曼陀羅DaturastramoniumL.,將種子放于4℃冰箱內(nèi)保存3個月,用GA3處理使種子萌發(fā),待幼苗長至5cm左右,以幼葉作為外植體。2方法2.1種子處理與播種將種子放于40℃溫水中浸泡1h,然后用自來水常溫浸泡24h,洗凈后分別用0(CK)、20、40、60mg/L的GA3分別處理1、5、10、15h,將種子播種于裝有濕沙培養(yǎng)皿中,每個處理30粒種子。每天觀察種子的萌發(fā)數(shù),計算種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢。2.2組織損傷的誘導和再生體系的構建2.2.1瓊脂糖的用量基本培養(yǎng)基為MS,pH5.8,蔗糖30g/L,瓊脂6.5g/L。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照強度1500lx,光照時間16h/d。2.2.2外植體的消毒處理曼陀羅幼苗經(jīng)自來水沖洗2h,用75%乙醇和0.1%HgCl2作為消毒劑,使用不同消毒方法消毒后,無菌水沖洗4~5次后把幼苗剪成1cm左右的外植體,用無菌濾紙吸干后接種于MS固體培養(yǎng)基預培養(yǎng),光照培養(yǎng)7d后記錄外植體污染數(shù)和存活數(shù)。2.2.3外植體接種方案取無菌的葉片切成5mm×5mm大小的外植體,采用表1設計的方案進行試驗,每組3個重復,每個接種5個外植體,培養(yǎng)基為MS。4周后統(tǒng)計愈傷組織誘導率(愈傷組織誘導率=出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù))。2.2.4外植體接種方法選取長勢較好的愈傷組織,采用L9(34)正交試驗表將實驗設計為9組,每組3個重復,每瓶接種3個外植體。分別將其接種在附加不同質(zhì)量濃度6-BA、NAA培養(yǎng)基上,30d后統(tǒng)計生芽率和平均發(fā)芽個數(shù),并分析試驗結果,正交試驗設計見表2。2.2.5生根情況觀察待叢生芽長到5~6cm時,剪下生長健壯的芽體接到MS固體培養(yǎng)基中,每瓶接種3株苗,每個水平重復3次,光照培養(yǎng)20d后,觀察其生根情況。選擇生長健壯的植株,打開瓶蓋,室內(nèi)培養(yǎng)3d,洗盡根上殘余的培養(yǎng)基,將小苗移栽于腐殖土和蛭石(5∶2)混合的土壤中溫室培養(yǎng),兩周澆1次不加激素和蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。3結果與分析3.1不同處理條件對發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響GA3可以解除種子的休眠,但不同質(zhì)量濃度的GA3和處理時間對種子萌發(fā)的影響不同。隨著處理質(zhì)量濃度和時間的增加,發(fā)芽率、發(fā)芽勢都先升高后降低。質(zhì)量濃度為60mg/L和處理時間為10h時,種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢最高,發(fā)芽率達73.33%,發(fā)芽勢達4.58%。所以,用60mg/LGA3處理10h時種子萌發(fā)效果最好(圖1)。3.2深入殺菌力適當?shù)南緯r間對獲得無菌的外植體很重要,70%~75%的乙醇具有較強的浸透力和殺菌力。結果見表3,外植體經(jīng)75%乙醇處理15s后再用0.1%HgCl2浸泡3min后獲得的無菌曼陀羅外植體具有較高的存活率,存活率達到70.59%,污染率較小,效果最佳。3.3結果表1將無菌葉片接種到培養(yǎng)基中約7d后,葉片周圍出現(xiàn)了少量較致密的淺黃色愈傷組織,隨時間的延長,愈傷組織體積迅速增加(圖2-A)。愈傷組織的誘導率和培養(yǎng)基中所含激素的濃度有關,結果見表4。當6-BA質(zhì)量濃度一定時,愈傷誘導率隨NAA質(zhì)量濃度升高而增大,在0.1mg/L時愈傷分化最高;當NAA質(zhì)量濃度一定時,隨6-BA質(zhì)量濃度的升高,愈傷組織誘導率先升高再降低,在0.5mg/L時分化最高。所以誘導愈傷組織最佳的培養(yǎng)條件為MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,誘導率達92.5%。結果表明,在誘導愈傷組織過程中,不但需要控制植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量濃度,而且應當控制生長素和細胞分裂素的配比。在脫分化過程中,生長素起主要作用,但與一定質(zhì)量濃度的細胞分裂素配比,效果會更好。3.4叢生芽的誘導選擇生長良好的愈傷組織,接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后,傷口處膨大并長出許多綠色突起,隨后小突起進一步膨大成叢生芽的芽點,隨著時間的延長,約30d后形成簇生綠色叢生芽(圖2-B)。第4組叢生芽的誘導率最高,為94.5%,平均發(fā)芽數(shù)17.78個,NAA和6-BA對叢生芽誘導結果的影響不顯著(P>0.05),叢生芽誘導結果見表5。極差分析表明影響曼陀羅叢生芽誘導因素依次為6-BA>NAA>MS,6-BA對叢生芽的形成影響較大,誘導叢生芽的最優(yōu)組合為A2B1C1,即MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。3.5曼陀羅幼根的誘導表達芽長至3~5cm時,將叢生芽切成單芽,轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。芽苗在轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8d之后小芽基部開始有白色突起形成,約15d培養(yǎng)基中長出較多的根,植株生長健壯,發(fā)育良好(圖2-C、D)。曼陀羅是熱帶陽生植物,對光的依賴性較強。組織培養(yǎng)所得曼陀羅幼苗比較脆弱,移栽過程中環(huán)境相對濕度過高時,根易染菌而死亡。組培苗經(jīng)過馴化后,移栽到室外的成活率較高,可達80%以上,植株生長正常(圖2-E)。4消毒方法的選擇在種子萌發(fā)過程中,要使種子快速萌發(fā)須破除種子的正常休眠,破除休眠有很多方法,如采用GA3、NaOH處理等,種子的破眠難易程度與種后熟存放時間長短有很大聯(lián)系。本實驗表明曼陀羅種子經(jīng)GA3破眠處理后種子萌發(fā)率顯著提高。另外在對種子進行破眠處理前用35℃溫水浸泡2h預處理后再用GA3破除休眠,比單獨使用GA3處理種子更好。組織培養(yǎng)過程中,獲得無菌外植體是建立植株再生體系的基礎,因此消毒劑和消毒方法的選擇尤為重要。75%的乙醇具有很強的浸透力和殺菌力,適當?shù)南緯r間對獲得無菌外植體也很重要。要特別注意的是,用HgCl2對植物材料消毒后要用無菌水反復沖洗,洗凈外植體上殘留的重金屬汞,避免汞對培養(yǎng)物產(chǎn)生進一步的毒害作用。在誘導愈傷組織和叢芽時,激素的配比極為關鍵。本實驗結果顯示,在誘導曼陀羅愈傷組織時,生長素和細胞分裂素的比值相對大,有利于愈傷