酶輔助提取斑玉孢多糖工藝的研究

酶輔助提取斑玉孢多糖工藝的研究

氨基弧菌屬于擔(dān)子菌亞門、層菌、傘菌、白蘑菇和玉簪科。這是一種稀有藥物和食品。斑玉蕈提取物對(duì)S180腫瘤、MethA纖維肉瘤、Lewis肺癌、HepG2等腫瘤均有明顯的抑制作用,還具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂等作用。多糖是真菌的主要活性成分之一,目前已經(jīng)上市的真菌多糖類保健品有上百種,在臨床上正式應(yīng)用的有香菇多糖、云芝多糖和裂褶菌多糖等多種,而未見有以斑玉覃多糖為主要成分的藥品及保健品。目前有關(guān)斑玉覃多糖的提取主要以熱水(或堿液)浸提法為主,存在費(fèi)時(shí)、耗能高、多糖活性損失較大等問題。酶輔助提取是近幾年發(fā)展起來的一種新技術(shù),酶處理可以提高多糖的得率,同時(shí)保持多糖的構(gòu)象與生物活性,目前尚未見應(yīng)用于斑玉覃多糖提取的報(bào)道。多糖提取率受到酶解溫度、pH、酶添加量等多種因素的影響,需要對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用酶輔助提取斑玉覃多糖,對(duì)提取工藝及抗氧化活性進(jìn)行研究,旨在為開發(fā)以斑玉覃多糖為主要成分的中藥及保健品提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1儀器、試劑和儀器斑玉蕈子實(shí)體江蘇徐州市售;木瓜蛋白酶(酶活≥100000U/g)、纖維素酶(酶活≥11000U/g)均為食品級(jí),購(gòu)自江蘇無(wú)錫;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)Sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;THZ-82型恒溫振蕩器常州國(guó)華電器有限公司;標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩浙江上虞華美儀器紗篩廠;風(fēng)選中藥粉碎機(jī)山東省青州市精誠(chéng)機(jī)械制造有限公司;FA2104N型電子分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司;SENCOR201L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海申生科技有限公司;TGL-20M型高速冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1斑玉蚤及其提取物的提取將新鮮斑玉蕈用清水洗凈,除去其根部,適當(dāng)切段于60℃干燥箱干燥,待斑玉蕈恒重,放入粉碎機(jī)中粉碎,過60目篩,干燥保存待用。準(zhǔn)確稱取2g斑玉蕈干粉,溶于一定體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中,預(yù)熱至酶解溫度,加入一定量的復(fù)合酶(木瓜蛋白酶和纖維素酶按1∶1質(zhì)量比例配合),恒溫振蕩器中提取一定時(shí)間。提取結(jié)束后沸水浴滅酶10min,冷卻,減壓抽濾,濾液濃縮后在4℃下用70%乙醇沉析12h、離心,所得沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3次,冷凍干燥后得斑玉蕈多糖。1.2.2測(cè)定茶多酚含量多糖得率(%)=斑玉蕈多糖質(zhì)量/斑玉蕈干粉質(zhì)量×100。1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)考察復(fù)合酶添加量(復(fù)合酶質(zhì)量占斑玉蕈粉質(zhì)量的百分比)、pH、酶解溫度、提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取其平均值。1.2.4-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)布置在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采取Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排四因素三水平實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素水平表如表1所示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取其平均值。1.2.5還原力測(cè)定2.2單次進(jìn)行,2.2單次進(jìn)行,2.2單次進(jìn)行還原力測(cè)定,2.2單次使用鐵氰化鉀法,5.2單次測(cè)定總有效率為5.2%;2.2%;5.2%a1.2.5.1DPPH自由基清除率測(cè)定DPPH自由基清除率測(cè)定參考Wu的方法,重復(fù)3次,取平均值。1.2.5.2還原力測(cè)定還原力測(cè)定采用鐵氰化鉀法,參考Oyaizu的方法,重復(fù)3次,取平均值。1.2.5.3羥基自由基清除率測(cè)定羥基自由基清除率測(cè)定采用鄰二氮菲比色法,重復(fù)3次,取平均值。2結(jié)果與分析2.1單因素實(shí)驗(yàn)2.1.1不同酶添加量對(duì)提取率的影響固定pH5.0,酶解溫度50℃,提取時(shí)間2h,考察不同復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響,結(jié)果見圖1。由圖1可知,多糖得率隨酶添加量增加而遞增,復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.8%后,提取增加率趨于平緩,這是因?yàn)榻狍w系中復(fù)合酶已接近飽和狀態(tài),致使多糖得率增長(zhǎng)平緩。考慮酶的成本,宜將復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為0.8%左右。2.1.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果固定復(fù)合酶添加量0.8%,酶解溫度50℃,提取時(shí)間2h,考察不同pH對(duì)多糖得率的影響,結(jié)果見圖2。多糖得率隨著pH的升高,先急劇增加后減少,這表明復(fù)合酶催化水解斑玉蕈細(xì)胞壁較適宜的pH范圍為5.0~6.0,低于或高于適宜pH時(shí),酶的活性降低,從而導(dǎo)致多糖得率降低。在pH5.5附近時(shí),多糖得率相對(duì)較高,故選擇較優(yōu)pH為5.5。2.1.3不同溫度對(duì)多糖細(xì)胞內(nèi)多糖群落狀態(tài)的影響多糖得率的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可知,多糖得率在40~55℃呈顯著增加的趨勢(shì),這是因?yàn)闇囟仍礁?浸提體系溶液的粘度越低,有助于胞內(nèi)多糖分子向外擴(kuò)散。但溫度大于55℃后,酶活受到抑制,多糖得率急劇下降,故選擇55℃為酶解溫度較優(yōu)值。2.1.4多糖得率的影響固定復(fù)合酶添加量0.8%,pH5.0,酶解溫度50℃,考察不同提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響,結(jié)果見圖4。多糖得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大,提取時(shí)間在1.0~2.5h之間,多糖得率顯著增加,當(dāng)時(shí)間超過2.5h后,提取增加率趨于平緩,表明大部分斑玉蕈多糖都已浸出,考慮到能耗,故選較優(yōu)提取時(shí)間為2.5h。2.2behsen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。2.2.1各因素對(duì)斑玉蚤多糖得率的影響對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后,得到多糖得率(Y)與復(fù)合酶添加量(x1)、酶解pH(x2)、酶解溫度(x3)和提取時(shí)間(x4)的回歸方程:對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。該模型達(dá)到極顯著水平(p<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),決定系數(shù)R2為0.9566,校正決定系數(shù)R2Adj為0.9132,信噪比RSN為14.92,可知該回歸方程擬合度和可信度均很高,故可用于設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的預(yù)測(cè)。各因素對(duì)斑玉蕈多糖得率的影響大小為:復(fù)合酶添加量>提取時(shí)間>酶解pH>酶解溫度。對(duì)表3回歸模型系數(shù)的顯著性分析可見,一次項(xiàng)中,x1、x4極顯著(p<0.01),x2、x3達(dá)到顯著水平(p<0.05);平方項(xiàng)的回歸系數(shù)均極顯著,說明各因素與多糖得率之間存在明顯的二次關(guān)系;二次項(xiàng)中僅有x1x4的回歸系數(shù)均達(dá)到顯著水平,表明復(fù)合酶添加量與提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)斑玉蕈多糖的得率有顯著影響。如將不顯著項(xiàng)全部剔除,會(huì)導(dǎo)致回歸模型發(fā)生改變,故保留p<0.25的各項(xiàng),簡(jiǎn)化后的回歸方程為式(2):2.2.2兩個(gè)因素之間的互動(dòng)效應(yīng)分析2.2.3提取時(shí)間與多糖得率通過所得回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳提取工藝條件為:復(fù)合酶添加量0.9%、酶解pH5.4、酶解溫度55.6℃、提取時(shí)間2.8h,在此條件下多糖得率的最大理論值為4.68%。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證,重復(fù)3次,實(shí)測(cè)平均得率為4.70%;對(duì)該工藝進(jìn)一步放大,取200g斑玉蕈干粉提取多糖,實(shí)測(cè)得率為4.72%,與預(yù)測(cè)值基本一致,表明該回歸模型具有較好的預(yù)測(cè)性能,可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。2.3斑點(diǎn)玉蓮茶多酚的抗逆活性2.3.1斑玉蚤多糖對(duì)dpph自由基的清除能力DPPH法是評(píng)價(jià)抗氧化活性的常用方法,抗氧化物質(zhì)可直接作用于DPPH自由基,使其顏色變淺,根據(jù)吸光度的變化可測(cè)定物質(zhì)的抗氧化活性。由圖6可知,在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍,斑玉蕈多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大,且呈良好的線性正相關(guān),線性方程為:y=4.2263+0.5831x,R2=0.9823。以半數(shù)效應(yīng)濃度(IC50值),即清除率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度,作為評(píng)價(jià)抗氧化能力的指標(biāo),由線性方程得斑玉蕈多糖清除DPPH自由基的IC50值為78.5μg/mL。2.3.2亞鐵氰化鉀吸光度法抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯(lián)系,還原力越強(qiáng),抗氧化性越強(qiáng)。鐵氰化鉀法測(cè)定原理為:亞鐵氰化鉀被樣品還原為鐵氰化鉀,鐵氰化鉀與Fe3+形成普魯士藍(lán),在700nm處有最大吸收峰,吸光度越大,則樣品的還原力越強(qiáng)。在50~250μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),斑玉蕈多糖的還原力隨著濃度的增加而增加,當(dāng)濃度為250μg/mL時(shí),吸光度最大為0.382±0.01。2.3.3自由基的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用羥基自由基是已知活性最強(qiáng)的活性氧自由基,可奪取蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的氧原子,引起機(jī)體損傷,清除羥基自由基可能是生物體抵御疾病的最有效方式之一。斑玉蕈多糖對(duì)羥基自由基的清除作用如圖8所示,在50~250μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),斑玉蕈多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大,且呈線性正相關(guān),線性方程為:y=-8.4173+0.3427x,R2=0.9802,IC50值為170.5μg/mL。3復(fù)合酶添加量對(duì)斑玉蚤多糖得率的影響本研究建立了酶輔助提取斑玉蕈多糖的最佳工藝條件,即復(fù)合酶(木瓜蛋白酶和纖維素酶按1∶1質(zhì)量比例配合)添加量0.9%、酶解pH5.4、酶解溫度55.6℃、提取時(shí)間2.8h,在此條件下多糖得率的最大理論值為4.68%。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證,重復(fù)3次,實(shí)測(cè)平均得率為4.70%,從實(shí)測(cè)多糖得率看,酶輔助提取優(yōu)于傳統(tǒng)的熱水浸提法,比熱水浸提得率3.38%(由本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得)高1.32%。斑玉蕈多糖具有較好的抗氧化活性,在一定范圍內(nèi),其抗氧化能力與多糖質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān),清除DPPH和羥基自由基的IC50值分別為78.5μg/mL和170.5μg/mL。多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法。由表3可知,僅復(fù)合酶添加量與提取時(shí)間的交互作用對(duì)斑玉蕈多糖的得率有顯著影響,固定酶解溫度和pH于零水平,繪出符合酶添加量與提取時(shí)間的交互效應(yīng)