產油微藻的篩選及鑒定

產油微藻的篩選及鑒定

隨著巖漿巖能源的日益稀缺，作為一種可替代能源，生境源受到了廣泛的關注。生物柴油因在能源密度、燃燒性能方面與化石柴油具有極高的相似性且具有環(huán)境友好、可再生等優(yōu)點,而被認為是解決能源危機的最好替代能源之一。以提取法從油類作物、地溝油和動物脂肪中獲得的生物柴油雖然具有眾多優(yōu)點,但是這些原料的來源十分有限,遠不能滿足人類社會發(fā)展的需要。進行微藻的大規(guī)模培養(yǎng)被認為是解決生物柴油原料問題的最具潛力的途徑。在過去的十多年里,美國、意大利、英國和日本等發(fā)達國家已相繼開展微藻培養(yǎng)和生物柴油制備等工作,國內的中國科學院、清華大學、北京大學、中國海洋大學、新奧集團和中石化等一些機構也正在積極開展這方面的研究,能源微藻的研究炙手可熱。然而,現(xiàn)階段進行微藻柴油的規(guī)?；a,還存在許多技術瓶頸。要解決這些技術瓶頸需要折中和糅合微藻代謝調控及藻種篩選等各種因素。發(fā)展能源微藻項目的第一步無疑是解決藻種問題,篩選油脂高產藻種時,同時要注意微藻生長速度、對當地氣候的適應能力以及在進行大規(guī)模培養(yǎng)時的經濟效益等因素。本文進行了產油微藻的分離和篩選方面的工作。從不同水域獲取多份水樣,建立了一套藻種分離方法,獲得了多株產油微藻。研究了這些藻種在自養(yǎng)和異樣條件下的產油情況,并對其中高產藻種進行了種類鑒定。1材料和方法1.1采樣本實驗使用的水樣采自江南大學校園內外幾條污水溝及無錫太湖水域。采集水樣用塑料瓶裝好,帶回實驗室進行分離純化。1.2藻種異養(yǎng)的培養(yǎng)藻種的自養(yǎng)培養(yǎng)和分離純化過程中采用BG11培養(yǎng)基;去除BG11培養(yǎng)基中的碳酸鈉,加入15g/L的葡萄糖作為藻種異養(yǎng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基初始pH均調到6.5左右,添加2%的瓊脂粉制備對應的固體培養(yǎng)基。1.3培養(yǎng)時間及培養(yǎng)溫度自養(yǎng)培養(yǎng):以培養(yǎng)至對數生長期的藻液為種子培養(yǎng)液,以10%(V/V)接種量接種于BG11培養(yǎng)基中,置于光照強度為3600lux、12h∶12h光照黑暗循環(huán)、培養(yǎng)溫度23±1℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20d。自養(yǎng)培養(yǎng)時每天搖晃培養(yǎng)液3~5次。異養(yǎng)培養(yǎng):以培養(yǎng)至對數生長期的藻液為種子培養(yǎng)液,以10%(V/V)接種量接種于添加葡萄糖作為唯一碳源的BG11培養(yǎng)基中,置于轉速為150r/min、溫度為23±1℃、無光照的搖床中培養(yǎng)7d。1.4單藻落的制備將采集的水樣先用紗布過濾除去大型顆粒物,濾液4000r/min離心20min。棄去上清液,加入10ml的BG11培養(yǎng)基,振蕩使藻細胞懸浮,適當稀釋后取0.1ml涂布于固體平板。培養(yǎng)20d后,用接種環(huán)挑出單藻落,將藻體轉到裝有2ml培養(yǎng)基的廣口小試管中,于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。15d后取長勢良好的藻液進行多次平板涂布和劃線純化,最后將純化的藻種進行保存。1.5藻株的初步鑒定藻種形態(tài)觀察與初步鑒定:用光學顯微鏡進行拍照觀察,參照《中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類和生態(tài)》進行藻株初步鑒定。藻種分子生物學鑒定:將已分離純化的單藻落平板,送到生工生物工程(上海)有限公司進行18srDNA測序,將得到的結果提交Genbank中進行Blast序列比對,基于MEGA軟件進行多重序列分析,并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.6藻粉油脂提取方法微藻生長曲線的測定:采用紫外可見分光光度儀測定藻懸液在680nm處的吸光值(OD680)。微藻生物量的測定:取4ml穩(wěn)定期的藻懸液于已稱重的5ml的離心管中,8000r/min離心5min,倒去上清液,蒸餾水振蕩洗滌2次后倒去上清液,然后將藻體在60~80℃的烘箱中烘干至恒重。稱重。油脂提取方法:稱取經低溫冷凍干燥的藻粉0.3g,置于50ml的離心管中。加入8ml4mol/L的HCl,振蕩器振蕩均勻后,靜置35min。然后沸水浴12min,接著迅速放入-20℃冰箱中,冰凍10~30min。取出離心管加入2倍體積氯仿甲醇(v/v,1∶1)提取劑,充分振蕩,浸提20min。接著4000r/min離心20min后,取氯仿層(下層)于另一支離心管,加等體積的0.15%NaCl溶液,4000r/min離心20min取氯仿層(底層)于已稱重的100ml的錐形瓶中。將瓶子放在60~80℃烘箱中烘至恒重。稱重,計算油脂含量。油脂含量的測定:油脂含量=(油脂質量/藻粉干重)×100%單位時間和體積的油脂產率的計算公式如下:x=m1×n1?m0×n0tx=m1×n1-m0×n0t公式中:m1為培養(yǎng)結束時藻體生物量,m0為接種時藻體生物量,n1為收獲時藻體的油脂含量,n0為接種時油脂含量,t為培養(yǎng)時間,x代表油脂產率。2結果與分析2.1小球藻、小環(huán)藻、綠球藻和小球藻微藻的形態(tài)特征從采集的水樣中分離純化出14株藻株,以微藻的顯微照片及其生長特征為依據,參照《中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài)》,將這些微藻初步鑒定為小球藻、柵藻、脆桿藻、小環(huán)藻和綠球藻。其藻種編號、采樣地點和培養(yǎng)特征等見表1,藻株形態(tài)見圖1。根據表1可知,不同藻株的藻落形態(tài)與顏色有一定差異,藻的沉降程度也因藻株而異。從圖1中可看出,柵藻屬藻種細胞以群體形態(tài)存在,小球藻、小環(huán)藻、脆桿藻細胞以單細胞狀態(tài)存在。2.21藻體生長情況的影響在相同的自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下,對14種微藻進行分批培養(yǎng),自養(yǎng)條件每兩天測一次OD值,異養(yǎng)條件每天測一次OD值,根據OD值作微藻的生長曲線。藻種的生長曲線如圖2a、2b和圖3a、3b所示(藻種Y13和Y14在自養(yǎng)培養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)過程中生長緩慢未測定)。從圖2中可以看到12種藻在16d左右生長速度放緩,在16到20d內12種藻OD值并沒有表現(xiàn)出下降的趨勢,為了便于分析,選擇第20d收獲藻體,測生物量并進行油脂提取。從圖3中可以看到在異養(yǎng)條件下藻的生長周期相對于在自養(yǎng)條件下明顯縮短,OD值明顯增加;且大部分藻在4到5d內進入穩(wěn)定期,選擇第7d收獲藻體,測生物量并進行油脂提取。對圖2與圖3對比可知,異養(yǎng)培養(yǎng)較自養(yǎng)培養(yǎng)周期明顯縮短,且穩(wěn)定期的OD值有顯著提高,以藻株Y06為例,其異養(yǎng)穩(wěn)定期的OD值是自養(yǎng)穩(wěn)定期OD值的6倍多。2.3藻株的油脂含量如圖4、圖5所示,比較了12種微藻在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下的生物量及油脂含量。從圖4可知,在自養(yǎng)條件下,12種藻株的生物量為0.97~1.73g/L,藻株Y06生物量最大為1.73g/L;在異養(yǎng)條件下,12種藻株的生物量為3.57~8.39g/L,藻株Y08的生物量最大為8.39g/L,藻株Y06的生物量為7.5g/L。根據圖5可知,自養(yǎng)條件下,12種藻株油脂含量為7.15%~16.71%,藻株Y10的油脂含量最高為16.71%,藻株Y06油脂含量為12.08%,藻株Y08的油脂含量為8.43%;異養(yǎng)條件下,12種藻株油脂含量為8.53%~21.22%,藻株Y09的油脂含量最高為21.22%,藻株Y06的油脂含量為20.87%,藻株Y08的油脂含量為8.53%。結合生物量和油脂含量可知,藻株Y06相對于其他藻株具有較好的產油潛力。2.41藻株在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下的油脂產率及收獲量利用生物量或總脂含量作為產油藻株的評價標準較為片面,據此引入油脂產率和油脂產量作為重要的參考指標。如表2所示,比較了12種微藻在自養(yǎng)條件和異養(yǎng)條件下的油脂產率和油脂收獲量。從表中可知,自養(yǎng)條件下,12種藻株的油脂產率為3.46~9.40mg/L·d,油脂產量為0.09~0.19g/L;異養(yǎng)條件下,12種藻株的油脂產率為69.96~201.29mg/L·d,油脂產量為0.49~1.41g/L。藻株Y06在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下都具有最高的油脂產率和油脂產量,其在異養(yǎng)條件下的油脂產率為201.29mg/L·d是自養(yǎng)條件下9.40mg/L·d的21.41倍;在異養(yǎng)條件下的油脂收獲量為1.41g/L是自養(yǎng)條件下0.19g/L的7.42倍。因此,選定藻株Y06作為最具有產油潛力的微藻。2.5系統(tǒng)進化分析對藻株Y06進行18SrDNA測序,序列長1633bp,與Genbank中現(xiàn)有的多個柵藻序列的相似度達到99%,其與Scenedesmusabundans(X73995.1)的相似度最高。從GenBank數據庫中選6株同源性相近的柵藻與藻株Y06一起構建系統(tǒng)進化樹,結果見圖6。其中藻株Y06與Scenedesmusabundans聚為一簇,靴帶支持率高達100%,確定藻株Y06為柵藻屬(Scenedesmusabundans)。3生物柴油藻種的產油性能本文建立了一套藻種分離方法,從自然界水體中共分離純化出14種藻株。同時對各藻株在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下生長情況做了初步研究,并以藻株在兩種不同條件下的的油脂產量和產率作為最重要的篩選條件,從中篩選出藻株Y06進行了種屬鑒定。根據藻株Y06的細胞形態(tài)特征,并結合藻株的18SrDNA分子生物學鑒定,確定藻株Y06為柵藻屬(Scenedesmusabundans)。藻株Y06在自養(yǎng)條件下油脂產率為9.40mg/L·d油脂產量為190mg/L是Mandal等對生物柴油藻種Scenedesmusobliquus進行自養(yǎng)培養(yǎng)30d獲得的油脂產量53mg/L的3.58倍;藻株Y06在異養(yǎng)條件下的油脂產率為201.29mg/(L·d)油脂產量為1.41g/L,是黃冠華等對小球藻進行條件調控培養(yǎng)14d后得到最高脂肪酸總產量1.04g/L的1.3倍,是Mandal等對生物柴油藻種Scenedesmusobliquus進行異養(yǎng)培養(yǎng)10d獲得的油脂產量0.586g/L的2.4倍?？梢?藻株Y06具有較好的產油潛力;同時該藻還具有容易培養(yǎng)、藻體易于收集和生物量大等優(yōu)點,藻株Y06可以作為下一步代謝調控優(yōu)化等研究的候選藻種。針對微藻生產中成本過高的問題,國內外許多學者提出利用污水培養(yǎng)微藻,污水深度處理與生物柴油生產