一般生殖毒性試驗(yàn)方法原則

第八講

生殖發(fā)育毒性及其試驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法編輯ppt第一節(jié)

概述

哺乳動(dòng)物的生育繁殖過程外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育的影響外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育損害作用的特點(diǎn)

2編輯ppt哺乳動(dòng)物的生育繁殖過程

生殖發(fā)育是哺乳動(dòng)物繁衍種族的生理過程，其中包含生殖細(xì)胞發(fā)生〔即精子發(fā)生和卵細(xì)胞發(fā)生〕、配子的釋放、性周期和性行為、卵細(xì)胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或著床、胚胎形成、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生〔或稱器官形成〕、胎仔發(fā)育、分娩和哺乳過程。生殖發(fā)育也可稱繁殖過程。3編輯ppt連續(xù)、完整的生殖發(fā)育過程的六個(gè)階段A.從交配前到受孕：檢查成年雄性和雌性生殖功能、配子的發(fā)育與成熟、交配行為、受精。B.從受孕到著床：檢查成年雌性生殖功能、胚胎著床前發(fā)育、著床。C.從著床到硬腭閉合：檢查成年雌性生殖功能、肧體發(fā)育、主要器官形成。D.從硬腭閉合到妊娠結(jié)束：檢查成年雌性生殖功能、胎體的發(fā)育與生長(zhǎng)、器官的發(fā)育與生長(zhǎng)。E.從出生到斷乳：檢查成年雌性生殖功能、新生仔對(duì)宮外生活的適應(yīng)性、斷乳前的發(fā)育與生長(zhǎng)。F.從斷乳到性成熟：檢查斷乳后的發(fā)育與生長(zhǎng)、對(duì)獨(dú)立生活的適應(yīng)、到達(dá)完全的性功能。4編輯ppt外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育的影響干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用?？梢酝ㄟ^對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是對(duì)性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)內(nèi)分泌功能也有調(diào)節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發(fā)育過程

。

5編輯ppt外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育損害作用的特點(diǎn)

生殖發(fā)育過程較機(jī)體其他系統(tǒng)更為敏感；外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育過程影響的范圍較為廣泛和深遠(yuǎn)。不僅直接涉及雌雄兩性個(gè)體，同時(shí)還對(duì)其第二代甚至以后世代的個(gè)體產(chǎn)生影響。

6編輯ppt第二節(jié)

生殖毒性及其評(píng)價(jià)

生殖毒性的表現(xiàn)生殖毒性的評(píng)價(jià)方法7編輯ppt1950年美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，懷孕期間服用黃體酮，先后有600多名女嬰出現(xiàn)生殖器男性化畸形。1956年用于治療妊娠反響的反響停，1961年后出現(xiàn)近萬例短肢畸形兒(海豹畸形)。二惡英(TCDD)造成的大面積污染及其與人群生殖危害的關(guān)系至今仍不清楚。過去半個(gè)世紀(jì)震驚全球的系列中毒或?yàn)?zāi)難事件的發(fā)生，在世界范圍內(nèi)提高了人們對(duì)用藥的平安意識(shí)，高度關(guān)注新的化學(xué)物對(duì)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)或妊娠結(jié)局的不良影響，促進(jìn)了與生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)平安相關(guān)法律的產(chǎn)生和研究方法指南的問世。8編輯ppt一、生殖毒性表現(xiàn)

外源化學(xué)物對(duì)生殖的過程的損害作用可以表現(xiàn)為性冷淡，性無能或各種形式的性功能減退。雌性可出現(xiàn)排卵規(guī)律改變，月經(jīng)失調(diào)或失經(jīng)，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表現(xiàn)為睪丸萎縮或壞死，精子數(shù)目減少。9編輯ppt對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的毒作用直接損傷睪丸中的細(xì)胞群對(duì)精子發(fā)生的有害作用繼發(fā)性的影響精子發(fā)生改變下丘腦-垂體功能直接影響睪丸細(xì)胞功能精子生成障礙性欲異常，喪失生育能力引起生殖細(xì)胞突變，造成可遺傳損害10編輯ppt對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的毒作用對(duì)卵巢的損害：卵母細(xì)胞數(shù)下降/突變；生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡降低，排卵抑制，受孕力下降；干擾卵巢內(nèi)分泌，影響受精/著床/胚胎發(fā)育生殖道的損害：影響運(yùn)送卵子/受精/受精卵發(fā)育對(duì)下丘腦-垂體系統(tǒng)的損害：閉經(jīng)，受孕力降低。11編輯ppt是檢查外源化學(xué)物對(duì)動(dòng)物生育繁殖機(jī)能有無損害作用的試驗(yàn)。評(píng)定的主要依據(jù)是交配后母體受孕情況〔受孕率〕、妊娠過程情況〔正常妊娠率〕、子代動(dòng)物分娩出生情況〔出生存活率〕、授乳哺育〔哺育成活率〕以及斷奶后發(fā)育情況等。二、生殖毒性的評(píng)價(jià)

12編輯ppt三段生殖毒性試驗(yàn)主要是根據(jù)發(fā)育階段的區(qū)別來設(shè)計(jì)的，每一段試驗(yàn)大致相當(dāng)于上述兩個(gè)階段。Ⅰ段：生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)〔一般生殖毒性試驗(yàn)〕主要反映妊娠前及妊娠初期的情況Ⅱ段：肧體-胎體毒性試驗(yàn)〔致畸試驗(yàn)〕Ⅲ段：出生前后發(fā)育毒性試驗(yàn)〔圍生期毒性試驗(yàn)〕反映外源化合物對(duì)胚胎發(fā)育后期、母代分娩過程、哺乳期的影響。13編輯pptⅠ段：生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)〔一般生殖毒性試驗(yàn)〕目的：評(píng)價(jià)受試物對(duì)配子成熟、交配行為、生育力、胚胎著床的影響〔前述生殖周期的A和B階段〕。給藥期：雄性從交配前4周開始染毒，并持續(xù)至交配成功；雌性交配前2周開始染毒〔以覆蓋3～4個(gè)動(dòng)情周期〕，至妊娠第6天受精卵著床。14編輯ppt受試動(dòng)物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔劑量分組：一般設(shè)立三個(gè)劑量組和兩個(gè)對(duì)照組高劑量組產(chǎn)生輕微毒性病癥，但其死亡率不大于10%，也不能完全喪失生育能力。相當(dāng)于1/10LD50。低劑量組那么不應(yīng)產(chǎn)生任何可觀察到的損害效應(yīng)。相當(dāng)于高劑量組的1/30。中劑量組應(yīng)僅能出現(xiàn)極為輕微的中毒病癥。如果1000mg/kg體重劑量對(duì)生育力無損害作用，或最高劑量可引起親代動(dòng)物表現(xiàn)一般毒性作用，但對(duì)生育力無不利影響，那么可不進(jìn)行其他劑量實(shí)驗(yàn)。一般生殖毒性試驗(yàn)方法原那么15編輯ppt染毒途徑:動(dòng)物接觸受試物的方法應(yīng)參照人類實(shí)際接觸途徑。

交配前雄性動(dòng)物應(yīng)染毒4-10周，雌性動(dòng)物2周

一般可混入飼料或飲水中，也可采用灌胃或膠囊法。動(dòng)物:至少采用一種動(dòng)物，推薦用大鼠；每組雌雄各20只；雌性動(dòng)物妊娠13-15天處死，雄性交配成功處死。16編輯ppt評(píng)價(jià)方法1.雄性生殖毒性評(píng)價(jià)〔動(dòng)物試驗(yàn)〕精子生成分析〔精子計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)及其活率〕精子功能檢測(cè)睪丸標(biāo)志酶活性檢測(cè)交配實(shí)驗(yàn)顯性致死試驗(yàn)17編輯ppt18編輯ppt19編輯ppt三代兩窩

2.雌性生殖毒性評(píng)價(jià)F０（斷奶或出生8周）

F３bF３aF１bF２bF２aF１a給予受試物8到12周

第一次交配第二次交配觀察三個(gè)月，喂飼普通飼料，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況

21天斷乳后給予受試物8到12周

觀察三個(gè)月，喂飼普通飼料，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況

21天斷乳后給予受試物8到12周

20編輯ppt兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗(yàn)

F２斷奶，檢查發(fā)育情況F２出生，每窩留８只幼仔F１交配斷奶，給予受試物F１（每窩選留幼仔８只，雌雄各半）第１６-１９周雌雄交配出生第８周給予受試物（F０）21編輯ppt受孕率:反映雌性動(dòng)物生育能力以及雌性動(dòng)物受孕情況

受孕率＝妊娠雌性動(dòng)物數(shù)／交配雌性動(dòng)物數(shù)×100％正常分娩率:

反映雌性動(dòng)物妊娠過程是否受到影響

幼子出生存活率＝正常分娩雌性動(dòng)物數(shù)／妊娠動(dòng)物數(shù)×100％幼仔出生存活率:

反映雌性動(dòng)物分娩過程是否正常

幼子出生存活率＝出生后4天存活幼子數(shù)／分娩時(shí)出生幼子數(shù)×100％幼仔哺育成活率:

反映雌性動(dòng)物授乳哺育幼仔的能力

幼子哺乳成活率＝21天斷乳幼子存活數(shù)／出生后4天幼子存活數(shù)×100％觀察指標(biāo)：22編輯ppt

生殖是對(duì)親代動(dòng)物而言，從配子生成、受精到胎體分娩是一生殖過程。

發(fā)育主要是對(duì)子代而言，從受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都屬于發(fā)育過程。發(fā)育毒性也稱為胚胎毒性。Ⅱ段：胚體-胎體毒性試驗(yàn)〔致畸試驗(yàn)〕23編輯ppt根本概念1.發(fā)育毒性(developmentaltoxicity)指出生前經(jīng)父體和(或)母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達(dá)成體之前出現(xiàn)的有害作用，也稱為胚胎毒性。具體表現(xiàn)可分為:生長(zhǎng)緩慢:即胚胎與胎仔的發(fā)育過程在外源化學(xué)物影響下，較正常的發(fā)育過程緩慢?；?由于外源化學(xué)物干擾，活產(chǎn)胎仔胎兒出生時(shí)，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。功能不全:即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動(dòng)及行為的缺陷或異常。胚胎死亡:某些外源化學(xué)物在一定劑量范圍內(nèi)，可在胚胎或胎仔發(fā)育期間對(duì)胚胎或胎仔具有損害作用，并使其死亡。24編輯ppt2.畸形、畸胎和致畸物畸形:器官形態(tài)的異常。致畸物或致畸原:凡在一定劑量下，能通過母體對(duì)胚胎或胎兒正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物?；?具有畸形的胚胎或胎仔。致畸試驗(yàn):評(píng)定外源化學(xué)物是否具有致畸作用的試驗(yàn)。3.胚胎毒性作用外源化學(xué)物引起的胎仔生長(zhǎng)發(fā)育緩慢和功能缺陷不全的損害作用，對(duì)母體無顯著的毒效應(yīng)。

25編輯ppt4.母體毒性作用

母體毒性作用是指外源化學(xué)物在一定劑量下，對(duì)受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥伏、直至死亡。母體毒性作用與致畸作用關(guān)系具有致畸作用，但無母體毒性出現(xiàn)。出現(xiàn)致畸作用的同時(shí)也表現(xiàn)母體毒性。不具有特定致畸作用機(jī)理，但可破壞母體正常生理穩(wěn)態(tài)。僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。在一定劑量下，既不呈現(xiàn)母體毒性，也未見致畸作用。

26編輯ppt5.畸形與變異在胚胎或胎兒出現(xiàn)器官形態(tài)結(jié)構(gòu)異常稱為畸形。機(jī)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理功能，在同一物種的子代與親代之間或子代的個(gè)體之間，有時(shí)出現(xiàn)不完全相同的現(xiàn)象，即為變異。27編輯ppt致畸作用的毒理學(xué)特點(diǎn)

器官發(fā)生期的胚胎對(duì)致畸物最為敏感劑量與效應(yīng)關(guān)系較為復(fù)雜劑量效應(yīng)關(guān)系復(fù)雜的表現(xiàn)及原因：在一定范圍內(nèi)，畸胎率與劑量成正比，當(dāng)高到一定水平引起胚胎死亡而掩蓋了致畸作用，畸胎率反而會(huì)下降。致畸作用的劑量效應(yīng)曲線較為陡峭，斜率很大。

致畸帶：從無作用劑量到胚胎死亡劑量的范圍28編輯ppt種屬差異以及個(gè)體差異在致畸作用中較為明顯在不同動(dòng)物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。種間差異即同一物種中不同品系之間存在的差異，在致畸作用中也極明顯。

致畸作用的毒理學(xué)特點(diǎn)

29編輯ppt致畸作用機(jī)理

Wilsom(1977)提出了畸形發(fā)生的9種機(jī)制，包括突變、染色體斷裂、有絲分裂改變、改變核酸完整性或功能、減少前體或底物的補(bǔ)給、減少能源支持、改變膜特性、滲透壓不平衡和酶抑制作用。近年來在分子水平的研究有很大的進(jìn)展，雖然胚胎有代償機(jī)制彌補(bǔ)外源性化學(xué)物的影響，但是，是否產(chǎn)生畸形依賴于在致病過程中的每個(gè)步驟在損傷和修復(fù)之間的平衡。

30編輯pptWilson發(fā)育毒理學(xué)根本原理〔一〕對(duì)致畸的易感性取決于孕體的基因型及其與有害環(huán)境因子相互作用的方式?！捕硨?duì)致畸的易感性隨著對(duì)有害因素暴露的發(fā)育時(shí)期的不同而變化?！踩持禄镆蕴禺惖姆绞健沧饔脵C(jī)制〕作用于發(fā)育的細(xì)胞和組織，啟動(dòng)一系列的異常發(fā)育事件〔細(xì)胞病理機(jī)制〕?！菜摹秤泻τ绊懩芊窠咏l(fā)育中的組織取決于有害影響本身的性質(zhì)?！参濉钞惓０l(fā)育的四種表型是：死亡、畸形、生長(zhǎng)緩慢和功能缺陷?！擦畴S著劑量的增加，異常發(fā)育表型的頻率和程度也隨之增加，從無毒作用到全部致死。編輯ppt基因突變引起胚胎發(fā)育異常細(xì)胞死亡和增致速度減慢細(xì)胞間通訊抑制胚胎中間代謝障礙胚胎組織發(fā)育過程的不協(xié)調(diào)

致畸作用機(jī)制

32編輯ppt外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)

傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)主要試驗(yàn)方案：由美國(guó)環(huán)境保護(hù)局〔EPA〕首先提出。1.三段生殖毒性試驗(yàn)主要用于評(píng)價(jià)藥物的生殖發(fā)育毒性。2.一代和多代生殖毒性試驗(yàn)主要用于評(píng)價(jià)食品添加劑、農(nóng)藥及其他化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性。3.改進(jìn)的大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性的試驗(yàn)程序。33編輯ppt動(dòng)物選擇:致畸試驗(yàn)的動(dòng)物選擇，除參照毒性試驗(yàn)中選擇動(dòng)物的一般原那么，即食性和對(duì)受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價(jià)廉外，還應(yīng)特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點(diǎn)。通常采用兩種動(dòng)物：一種嚙齒類，首選大鼠；另一種非嚙齒類推薦家兔。34編輯ppt劑量分組：一般應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試，目的是找出引起母體中毒的劑量。最少設(shè)3個(gè)劑量組，另設(shè)對(duì)照組。原那么上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組為無母體和胚胎毒性反響；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒病癥。其劑量與高劑量和低劑量成等比級(jí)數(shù)關(guān)系。一般最高劑量不超過LD50的1/5～1/3，低劑量可為1／100～1／30。35編輯ppt給藥期：在胚胎器官形成期連續(xù)給藥〔由胚胎著床到硬腭閉合〕，大鼠孕后6～15天，家兔6～18天。由于致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動(dòng)物接觸受試物的時(shí)間，必須在器官發(fā)生期。36編輯ppt動(dòng)物交配處理：

每組動(dòng)物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動(dòng)物3～4只。

將性成熟雌雄動(dòng)物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對(duì)照組。出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。

37編輯ppt胎仔檢查：

自然分娩前1-2日將受孕動(dòng)物處死，剖腹取出子宮及活產(chǎn)胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后約第20天，小鼠第19天，家兔在第29天。38編輯ppt活胎、早期死亡胚胎〔包括吸收胚胎〕、晚期死亡胚胎的鑒別方法：〔1〕活胎：胚胎已完整成形，色鮮紅，有自然運(yùn)動(dòng)，機(jī)械刺激后有運(yùn)動(dòng)反響?！?〕早期死亡胚胎：胚胎的大小、外形和色澤可因死亡時(shí)間的相對(duì)遲早及死后自溶時(shí)間的長(zhǎng)短變化很大，一般胎盤較小或不明顯，胚胎形體較小，外形不完整，各部位發(fā)育尚未完全，呈紫紅色，無自然動(dòng)作。39編輯ppt早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外觀，也分不清胚胎和胎盤，僅在子宮內(nèi)膜上隆起如一小瘤，故有人稱它為胎膜瘤；如已完全被吸收，那么可稱為吸收點(diǎn)，即為最早的早期死胎?！?〕晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明顯胎盤，但色澤灰暗，無光澤，無自然運(yùn)動(dòng)，機(jī)械刺激后亦無運(yùn)動(dòng)反響。40編輯ppt以下幾方面進(jìn)行畸形檢查：外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等?；螜z查只限活產(chǎn)胎仔。41編輯ppt結(jié)果評(píng)定：活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù):即根據(jù)出現(xiàn)的畸形總數(shù)，計(jì)算每個(gè)活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)的畸形平均數(shù)?；町a(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)＝畸形總數(shù)／活產(chǎn)幼子總數(shù)畸形出現(xiàn)率：即作為畸胎的幼仔在活產(chǎn)幼仔總數(shù)中所占的百分率。

畸胎出現(xiàn)率＝出現(xiàn)畸形的胎仔總數(shù)／活產(chǎn)胎仔總數(shù)母體畸胎出現(xiàn)率:即出現(xiàn)畸形胎仔的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。母體畸胎出現(xiàn)率＝出現(xiàn)畸胎的母體數(shù)／妊娠母體數(shù)42編輯ppt致畸指數(shù)=母體LD50/最小致畸劑量致畸危險(xiǎn)指數(shù)=最大不致畸劑量/最大可能攝入量致畸指數(shù)可用于判定致畸作用帶的寬窄和致畸性的強(qiáng)弱。致畸指數(shù)小于10者一般不致畸，10～100者為致畸，大于100者為強(qiáng)致畸。對(duì)于有害物質(zhì)在食品中存在時(shí)人體受害幾率，可計(jì)算致畸危害指數(shù)。指數(shù)大于300,對(duì)人危害小；100～300對(duì)人危害中等；小于100對(duì)人危害大。母體毒性／發(fā)育毒性〔對(duì)母體最低損害作用劑量A／胎仔最低損害作用劑量D〕：比值越大，危險(xiǎn)性越高。A／D≥3,具有發(fā)育毒性危險(xiǎn)性；A／D<3，相對(duì)危險(xiǎn)較低或不具危險(xiǎn)性。43編輯ppt基準(zhǔn)A類B類C類D類1.最小母體