蛋白質(zhì)與酶綜合項目工程復(fù)習(xí)資料

酶工程復(fù)習(xí)提綱緒論酶及酶工程概念。酶：是生物體內(nèi)一類具備催化活性和特殊空間構(gòu)象生物大分子物質(zhì)。酶工程：運(yùn)用酶催化作用，在一定生物反映器中，將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成所需產(chǎn)品一門工程技術(shù)。(名詞解釋)理解酶學(xué)發(fā)展歷史，特別是某些核心事件。1833年，Payen和Persoz發(fā)現(xiàn)了淀粉酶。1878年，Kuhne初次將酵母中進(jìn)行乙醇發(fā)酵物質(zhì)稱為酶。給酶一種統(tǒng)一名詞，叫Enzyme，這個詞來自希臘文，其意思“在酵母中”。19，Henri提出中間產(chǎn)物學(xué)說。19，MichaelisandMenton推導(dǎo)出酶催化反映基本動力學(xué)方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。1926年，Summer分離純化得到脲酶結(jié)晶。人們開始接受“酶是具備生物催化功能蛋白質(zhì)”。CechandAltman于1982和1983年發(fā)現(xiàn)具備催化活性RNA即核酸類酶，1989年獲諾貝爾化學(xué)獎。現(xiàn)已鑒定出5000各種酶，上千種酶已得到結(jié)晶，并且每年均有新酶被發(fā)現(xiàn)。理解酶在醫(yī)藥、食品、輕工業(yè)方面應(yīng)用。醫(yī)藥：（1）用酶進(jìn)行疾病診斷：通過酶活力變化進(jìn)行疾病診斷，谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶用于診斷肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于測定血糖含量，診斷糖尿病。（2）用酶進(jìn)行疾病治療：來源于蛋清、細(xì)菌溶菌酶用于治療各種細(xì)菌性和病毒性疾病；來源于動物、蛇、細(xì)菌、酵母等凝血酶用于治療各種出血??；來源于蚯蚓、尿液、微生物纖溶酶用于溶血栓。（3）用酶制造各種藥物：來源于微生物青霉素?；赣糜谥圃彀牒铣汕嗝顾睾皖^孢菌素；來源于動物、植物、微生物蛋白酶用于生產(chǎn)L-氨基酸。食品：生產(chǎn)低聚果糖，原料為蔗糖，所需酶為果糖基轉(zhuǎn)移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、擔(dān)子菌）；生產(chǎn)低聚異麥芽糖，原料為淀粉，所需酶為α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普魯蘭酶、糖化型α-淀粉酶（枯草桿菌）。輕工業(yè)：用酶進(jìn)行原料解決；用酶生產(chǎn)各種輕工、化工產(chǎn)品；用酶增強(qiáng)產(chǎn)品使用效果。酶學(xué)基本酶化學(xué)本質(zhì)？酶與其她無機(jī)或者有機(jī)催化劑相比較，具備哪些催化特性？化學(xué)本質(zhì)：生物催化劑。催化特性：（1）高效率：比非催化高10^8—10^20倍；比非酶催化高10^7—10^13倍，酶催化反映效率之因此高，是由于酶催化反映可以使反映所需要活化能明顯減少。（2）高度專一性：相對專一性、絕對專一性。相對專一性：鍵專一性：作用于具備相似化學(xué)鍵一類底物；基團(tuán)專一性：酶作用底物具有某一相似基因。絕對專一性：一種酶只能催化一種底物進(jìn)行一種反映。（3）反映條件溫和：普通在常溫、常壓、pH值近乎中性條件下進(jìn)行。（4）酶催化是可調(diào)控。解釋酶作用專一性機(jī)制學(xué)說有哪些？其核心內(nèi)容？（填空）鎖鑰假說：整個酶分子天然構(gòu)象是具備剛性構(gòu)造，酶表面具備特定形狀。酶與底物結(jié)合猶如一把鑰匙對一把鎖同樣。誘導(dǎo)契合假說：酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)固定形狀，而只是由于底物誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)性狀。當(dāng)?shù)孜锱c酶接近時，底物分子可以誘導(dǎo)酶活性中心構(gòu)象發(fā)生變化，使之成為能與底物分子密切結(jié)合構(gòu)象。解釋酶作用高效性機(jī)制有哪些？（1）鄰近效應(yīng)與定向作用（2）電子張力作用：應(yīng)變效應(yīng)，底物分子敏感鍵產(chǎn)生張力或變形（3）多元催化作用。酸堿催化：指通過向反映物提供質(zhì)子或從反映物奪取質(zhì)子而穩(wěn)定過渡態(tài)、加速反映一類催化機(jī)制。共價催化：某些酶分子能作為親核催化劑或親電催化劑分別放出或汲取電子而與底物分子形成不穩(wěn)定共價中間絡(luò)合物，反映活化能減少而加速反映，稱為共價催化。（4）酶活性中心低介電區(qū)：表面效應(yīng)，微環(huán)境效應(yīng)。什么是酶活性中心？活性中心構(gòu)成？活性中心：是指酶分子中直接與底物結(jié)合并完畢酶催化反映構(gòu)造區(qū)域，該部位化學(xué)基團(tuán)集中，并構(gòu)成一定空間構(gòu)象?；钚灾行臉?gòu)成：結(jié)合中心：與底物結(jié)合部位，決定酶專一性；催化中心：增進(jìn)底物發(fā)生化學(xué)反映某些，決定酶所催化反映性質(zhì)。酶一級構(gòu)造、二級構(gòu)造、三級構(gòu)造和四級構(gòu)造概念，酶四級構(gòu)造與催化功能關(guān)系？酶一級構(gòu)造：一級構(gòu)造是指構(gòu)成酶蛋白氨基酸構(gòu)成一條長肽鏈或多肽鏈。酶一級構(gòu)造是酶基本化學(xué)構(gòu)造，是催化功能基本。酶二級構(gòu)造：二級構(gòu)造是指肽鏈骨架相鄰區(qū)段借助氫鍵等沿軸向方向建立規(guī)則折疊片與螺旋。是所有酶必要具備空間構(gòu)造，是維持酶活性部位所必須構(gòu)象。酶三級構(gòu)造：三級構(gòu)造指在二級構(gòu)造基本上肽鏈進(jìn)一步折疊片與盤繞成二維空間構(gòu)造，多肽鏈中本來相距較遠(yuǎn)序列可以集中到一種區(qū)域內(nèi)。酶四級構(gòu)造：在三級構(gòu)造基本上，由幾種到十?dāng)?shù)個亞基(或單體)構(gòu)成寡聚酶或生物大分子稱為酶四級構(gòu)造。關(guān)系：1、什么是同工酶，舉例闡明？指能催化相似化學(xué)反映，但酶蛋白自身分子構(gòu)造構(gòu)成及理化性質(zhì)不同一組酶。如：乳酸脫氫酶LDH，可裝配成H4、H3M、H2M2、HM3、M4五種四聚體。依照酶催化反映類型和機(jī)制不同，酶分類？填空題（1）、氧化還原酶類：催化氧化還原反映（2)、轉(zhuǎn)移酶類：催化分子基團(tuán)從一種分子轉(zhuǎn)移到另一種分子反映（3）、水解酶類：催化加水分解反映（4）、裂合酶類：雙鍵上去除或加入一種基團(tuán)反映（5）、異構(gòu)酶類：催化分子間重排關(guān)于反映（6）、連接酶類：催化將兩個分子連接在一起，并由ATP提供能量反映酶活力及比活力？國際酶活力單位IU如何定義？酶活力：在一定條件下，酶所催化某一化學(xué)反映速度，可用時間單位內(nèi)底物減少量或產(chǎn)物增長量來表達(dá)。比活力：指在特定條件下，每毫克酶蛋白所具備酶活力單位數(shù)。國際酶活力單位IU：在最適反映條件（溫度25℃）下，每分鐘內(nèi)催化一微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物酶量定為一種酶活力單位，1IU=1μmol/min酶促反映動力學(xué)酶促反映初速度概念？在研究酶促反映動力學(xué)中，為精確表達(dá)酶活力，普通都用初速度表達(dá)，即酶反映初始階段，即底物轉(zhuǎn)化量＜5%時反映速度，也就是進(jìn)程曲線直線某些。中間產(chǎn)物學(xué)說和過渡態(tài)理論？中間產(chǎn)物學(xué)說：酶中間產(chǎn)物學(xué)說是由Brown（1902）和Henri（1903）提出。其學(xué)說重要以為酶高效催化效率是由于酶一方面與底物結(jié)合，生成不穩(wěn)定中間產(chǎn)物（又稱中心復(fù)合物centralcomplex）。然后分解為反映產(chǎn)物而釋放出酶。在酶促反映中，酶一方面和底物結(jié)合成不穩(wěn)定中間配合物（ES），然后再生成產(chǎn)物（P），并釋放出酶。反映式為S+E=ES→E+P，這里S代表底物，E代表酶，ES為中間產(chǎn)物，P為反映產(chǎn)物過渡態(tài)理論：過渡態(tài)理論即活化絡(luò)合物理論，（transition-statetheory）。過渡態(tài)：以量子力學(xué)對反映過程中能量變化研究為根據(jù)，以為從反映物到生成物之間形成了勢能較高活化絡(luò)合物，活化絡(luò)合物所處狀態(tài)叫過渡態(tài)。過渡態(tài)理論是1935年由A.G.埃文斯和M.波拉尼提出，研究有機(jī)反映中由反映物到產(chǎn)物過程中過渡態(tài)理論。米氏方程動力學(xué)描述形式，Km,Vmax動力學(xué)參數(shù)意義。（3,4題合成一種大題）V=Vmax[S]/（Km+[S]）意義：（1）當(dāng)v=Vmax/2時，Km=[S]。因而，Km等于酶促反映速度達(dá)最大值一半時底物濃度，它單位是摩爾/升。（2）Km可以反映酶與底物親和力大小。Km越小，酶與底物親和力越大。（3）可用于判斷反映級數(shù)：當(dāng)[S]＜0.01Km時，反映為一級反映；當(dāng)[S]＞100Km時，v=Vmax，反映為零級反映；當(dāng)0.01Km＜[S]＜100Km時，為混合級反映。（4）Km是酶特性性常數(shù)：在一定條件下，某種酶Km值是恒定，因而可以通過測定不同酶（特別是一組同工酶）Km值，來判斷與否為不同酶。（5）Km可用來判斷酶最適底物：當(dāng)酶有幾種不同底物存在時，通過測定酶在不同底物存在時Km值，Km值最小者，即為該酶最適底物。（6）可用來擬定酶活性測定期所需底物濃度：當(dāng)[S]=10Km時，v=91%Vmax，以為此時為最適當(dāng)測定酶活性所需底物濃度。如何測定Km,Vmax?Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法動力學(xué)表述形式。

酶激活劑概念？激活劑種類？酶激活劑：凡能提高酶活性，加速酶促反映進(jìn)行物質(zhì)都稱為激活劑或活化劑。種類（按分子大小分類）：（1）無機(jī)離子：無機(jī)陽離子——金屬離子（如鈉離子、鉀離子、鎂離子等）；無機(jī)陰離子（如氯離子、溴離子等）；氫離子。（2）中檔大小有機(jī)分子：某些還原劑，如半胱氨酸、巰基乙醇、抗壞血酸，作用機(jī)制是使酶中二硫鍵還原成巰基，從而提高酶活性或與底物、酶或ES復(fù)合；EDTA（乙二胺四乙酸），作用機(jī)制是金屬螯合劑，解除重金屬離子對酶抑制作用。（3）具備蛋白質(zhì)性質(zhì)大分子物質(zhì)（如酶原激活）。酶反映器酶反映器定義？用于酶進(jìn)行催化反映容器及其附屬設(shè)備稱為酶反映器。2.按構(gòu)造區(qū)別，常用酶反映器類型、定義及其特點？（類型有哪些以及填充式反映器定義）大題定義特點攪拌罐式反映器：又稱為批量反映器、間歇式攪拌罐。由容器、攪拌器及保溫裝置構(gòu)成，底物與酶一次性投入反映器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出，反映完畢之后，酶（細(xì)胞）用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批反映一類反映器。反映比較完全，反映條件比較容易調(diào)節(jié)控制填充床式反映器：將固定化酶填充于反映器內(nèi)，制成穩(wěn)定柱床，然后，通入底物溶液，在一定條件下實現(xiàn)酶催化反映，以一定流速，收集輸出轉(zhuǎn)化液（含產(chǎn)物）密度大，可以提高酶催化反映速度。在工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用。流化床式反映器：將底物溶液以足夠大流速，從反映器底部向上通過固定化酶柱床，使固定化酶顆粒始終處在流化狀態(tài)，使反映液混合限度介于全混型和平推流型之間。即可用于解決黏度較大和具有固體顆粒底物溶度，同步亦可用于需要供氣體或排放氣體（即固、液、氣三相反映）酶反映器稱為流化床式反映器混合均勻，傳質(zhì)和傳熱效果好，溫度和PH值調(diào)節(jié)控制比較容易，不易堵塞，對粘度較大反映液也可進(jìn)行催化反映鼓泡式反映器：是運(yùn)用從反映器底部通入氣體產(chǎn)生大量氣泡，在上升過程中起到提供反映底物和混合兩種作用一類反映器。也是一種無攪拌裝置反映器。構(gòu)造簡樸，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質(zhì)、傳熱效率高，適合于有氣體參加反映。膜反映器：是一種將酶催化反映與半透膜分離作用組合在一起而成反映器，可以用于游離酶催化反映，也可以用于固定化酶催化反映。清洗比較困難噴射式反映器通入高壓噴射蒸汽，實現(xiàn)酶與底物混合，進(jìn)行高溫短時催化反映，合用于某些耐高溫酶一類反映器稱為噴射式反映器。通入高壓噴射蒸汽，實現(xiàn)酶與底物混合，進(jìn)行高溫短時催化反映合用于某些耐高溫酶反映3.選取和使用酶反映器時，要考慮哪些因素？所用生物催化劑應(yīng)具備較高比活和酶濃度（或細(xì)胞濃度），才干得到較大產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率。能用電腦自動檢測和調(diào)控，從而獲得最佳反映條件。應(yīng)具備良好傳質(zhì)和混合性能。傳質(zhì)是指底物和產(chǎn)物在反映介質(zhì)中傳遞。傳質(zhì)阻力是反映器速度限制重要因素。應(yīng)具備最佳無菌條件，否則，雜菌污染使反映器生產(chǎn)能力下降。酶生產(chǎn)酶生產(chǎn)辦法有哪些，各自特點如何？提取分離法：采用各種提取、分離純化技術(shù)從動物、植物組織、器官、細(xì)胞或微生物細(xì)胞中將酶提取出來，再進(jìn)行分離純化過程。特點：長處是設(shè)備簡樸、操作以便；缺陷是易受影響、工藝路線復(fù)雜。生物合成：運(yùn)用微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞生命活動而獲得人們所需酶技術(shù)過程。特點：長處是生產(chǎn)周期短、產(chǎn)率高、不受外界條件影響；缺陷是設(shè)備及工藝規(guī)定高、生產(chǎn)過程需嚴(yán)格控制?；瘜W(xué)合成：特點是原料單體純度規(guī)定高、只可合成已知化學(xué)構(gòu)造酶。什么是構(gòu)成型酶和調(diào)節(jié)型酶？構(gòu)成型酶：生物細(xì)胞中合成酶量比較恒定，環(huán)境對這些酶合成速率影響不大。如DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途徑各種酶等。調(diào)節(jié)型酶：生物細(xì)胞中合成酶含量變化很大，其合成速率明顯受到環(huán)境因素影響。如大腸桿菌β—半乳糖苷酶。什么是酶誘導(dǎo)？什么是酶阻遏？什么實驗證明了這兩種現(xiàn)象？酶誘導(dǎo)：某些代謝物可以誘導(dǎo)某些酶合成，是通過增進(jìn)為該酶編碼基因表達(dá)而進(jìn)行，這種現(xiàn)象叫做酶合成誘導(dǎo)。（名詞解釋）證明實驗：分解運(yùn)用乳糖酶有：β—半乳糖苷酶、β—半乳糖苷透過酶、硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；大腸桿菌生長在唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；當(dāng)換成葡萄糖培養(yǎng)基時，三種酶基本消失；表白菌體生物合成經(jīng)濟(jì)原則：需要時才合成。酶阻遏：某些代謝物可以制止某些酶合成，是通過制止為該酶編碼基因表達(dá)而進(jìn)行，這種現(xiàn)象叫做酶合成阻遏。證明實驗：（1）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖培養(yǎng)基上時，檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶存在；（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶活性減少，直至消失；（3）表白色氨酸存在組織了色氨酸合成酶合成，體現(xiàn)了菌生長經(jīng)濟(jì)原則：不需要就不合成。微生物生產(chǎn)酶長處，產(chǎn)酶微生物基本規(guī)定？長處：微生物種類繁多：產(chǎn)酶微生物多；一種微生物產(chǎn)好幾種酶；微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)以便；微生物易改造，可通過各種手段哺育新種?；疽?guī)定：不是致病菌、安全可靠，無毒性；發(fā)酵周期短，產(chǎn)酶量高；不易變異退化；最佳是產(chǎn)生胞外酶菌種，利于分離純化?？梢酝ㄟ^哪些途徑獲得產(chǎn)酶微生物從自然界中搜尋所需要產(chǎn)酶微生物；從菌種保藏中心篩選；從基因庫篩選微生物發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)方式有哪些？固體發(fā)酵培養(yǎng)：以麩皮、米糠為重要原料，加入其她必要營養(yǎng)成分，制成固體或半固體麩曲后，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶。液體深層發(fā)酵：采用液體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后接種產(chǎn)酶菌，在一定條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。固定化細(xì)胞發(fā)酵：將細(xì)胞固定在水不溶性載體上，在一定空間范疇內(nèi)進(jìn)行生命活動而產(chǎn)酶。固定化原生質(zhì)體發(fā)酵：利于胞內(nèi)物質(zhì)透過細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外。分析提高微生物產(chǎn)酶量辦法有哪些？（1）針對性地打破生物細(xì)胞內(nèi)酶蛋白合成機(jī)制，可從兩方面入手：條件控制：發(fā)酵條件優(yōu)化：控制溫度、PH，優(yōu)化培養(yǎng)基，依照需求供應(yīng)無菌空氣，掌控發(fā)酵周期，擬定放罐時間，避免自溶。采用添加誘導(dǎo)物、解除阻遏物、流加等技術(shù)提高產(chǎn)酶量。（2）遺傳控制：涉及基因突變和基因重組。什么是基因重組？構(gòu)建基因工程菌普通流程是什么？依照人們預(yù)先設(shè)想，運(yùn)用酶學(xué)辦法，將目基因重組到一種適當(dāng)載體上，構(gòu)成重組子，將重組子轉(zhuǎn)化到恰當(dāng)受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增表達(dá)，以達(dá)到改造生物細(xì)胞目技術(shù)。流程：目基因片段產(chǎn)生和分離；目基因片段共價連接到載體上，即體外重組；體外重組雜合分子轉(zhuǎn)入適當(dāng)宿主；篩選和檢測。設(shè)計一種實驗方案從自然環(huán)境中篩選獲得一株產(chǎn)α-淀粉酶微生物，并獲取其編碼α-淀粉酶基因。簡述該實驗方案基本原理，并描述實驗流程。PCR擴(kuò)增后測序獲得基因序列酶分離純化酶提取、分離純化普通技術(shù)路線。細(xì)胞破碎辦法及其原理。填空機(jī)械破碎——通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生剪切力，使組織、細(xì)胞破碎?！獡v碎法、研磨法、勻漿法；物理破碎——通過各種物理因素作用，使組織、細(xì)胞外層構(gòu)造破壞，而使細(xì)胞破碎?！獪囟炔钇扑榉?、壓力差破碎法、超聲波破碎法；化學(xué)破碎——通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜作用，而使細(xì)胞破碎。——有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿，表面活性劑：Triton、Tween；酶促破碎——通過細(xì)胞自身酶系或外加酶制劑催化作用，使細(xì)胞外層構(gòu)造受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎?！匀芊ā⑼饧用钢苿┓?。什么是鹽溶？什么是鹽析？鹽溶現(xiàn)象：大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，并且在低濃度鹽存在條件下，酶溶解度隨鹽濃度升高而增長，稱為鹽溶現(xiàn)象。鹽析：在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶溶解度隨鹽濃度升高而減少，這稱為鹽析現(xiàn)象。酶沉淀分離辦法有哪些？鹽析沉淀、等電點沉淀、有機(jī)溶劑沉淀原理。大題鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法、選取性變性沉淀法。鹽析沉淀原理：運(yùn)用不同蛋白質(zhì)在不同鹽濃度條件下溶解度不同特性，通過在酶液中添加一定濃度中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離。等電點沉淀法原理：運(yùn)用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同兩性電解質(zhì)有不同等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。有機(jī)溶劑沉淀原理：運(yùn)用酶與其她雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度不同，通過添加一定量某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。什么是膜分離？膜分離基本類型和截留重要物質(zhì)。膜分離：借助于一定孔徑高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。基本類型：（1）加壓膜分離：微濾、超濾、反滲入；微濾截留物質(zhì)為尺寸不不大于0.1-10μm微生物和微粒子，超濾截留物質(zhì)為分子量在500以上高分子，反滲入截留物質(zhì)為小分子物質(zhì)。（2）電場膜分離：電滲析、離子互換膜電滲析；陽膜截留陰離子，陰膜截留陽離子。（3）擴(kuò)散膜分離：透析。截留物質(zhì)為大分子溶質(zhì)。什么是吸附層析？分派層析？離子互換層析？凝膠層析？親和層析？層析聚焦？各自分離根據(jù)？吸附層析：運(yùn)用吸附劑對不同物質(zhì)吸附力不同而使混合物中各組分分離。分派層析：運(yùn)用各組分在兩相中分派系數(shù)不同，而使各組分分離辦法。離子互換層析：運(yùn)用離子互換劑上可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子親和力不同而達(dá)到物質(zhì)分離。凝膠層析：以各種多空凝膠為固定相，運(yùn)用流動相中所含各組分相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離。親和層析：運(yùn)用生物分子與配基之間所具備專一而又可逆親和力，是生物分子分離純化。層析聚焦：將酶等兩性物質(zhì)等電點特性與離子互換層析特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離。對于某種酶制劑，如α-淀粉酶，如何檢查其與否達(dá)到預(yù)期純化精度規(guī)定？計算酶活力和比活力、回收率、提純倍數(shù)。回收率：提純前與提純后酶總活力之比，表達(dá)提純過程中酶損失限度大小?；厥章试礁邠p失越小提純倍數(shù)：提純先后比活力之比，這是表達(dá)提純過程中純度提高倍數(shù)。提純倍數(shù)越大，表達(dá)該辦法純化效果越好。固定化酶和細(xì)胞酶固定化是為了克服游離酶應(yīng)用過程中哪些缺陷？酶穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫酶，以及胃蛋白酶等可以耐受較低pH條件以外，大多數(shù)酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。酶一次性使用：酶普通都是在溶液中與底物反映，酶在反映系統(tǒng)中與底物和產(chǎn)物混在一起，反映結(jié)束后，雖然酶仍有很高活力，也難于回收運(yùn)用。這種一次性使用酶方式，不但使生產(chǎn)成本提高，并且難于持續(xù)化生產(chǎn)。產(chǎn)物分離純化較困難：酶反映后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混合在一起，無疑給產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化帶來一定困難。什么是固定化酶？固定化酶長處和缺陷？固定化酶：在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)酶，能持續(xù)進(jìn)行反映，反映后酶可以回收重復(fù)運(yùn)用。長處：（1）不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；（2）可重復(fù)使用；（3）可持續(xù)化生產(chǎn)；（4）穩(wěn)定性好。缺陷：（1）固定化過程中往往會引起酶失活；（2）初次制備成本較高；（3）合用于可溶性底物，特別可溶性小分子底物，對大分子不適當(dāng)。酶固定化有哪些辦法，優(yōu)缺陷？（1）非化學(xué)結(jié)合法：物理吸附法：運(yùn)用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化辦法。長處是操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體便宜易得，并且可以重復(fù)使用。缺陷是由于靠非化學(xué)吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，因此使用受到一定限制。離子結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合固定化辦法。長處是條件溫和，操作簡樸，制備過程中，活力損失較少。缺陷是離子鍵結(jié)合力較弱，結(jié)合力不牢固，在pH和離子強(qiáng)度等條件變化時，酶容易脫落。（2）化學(xué)結(jié)合法：交聯(lián)法：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀構(gòu)造固定化酶辦法稱為交聯(lián)法。長處是結(jié)合牢固，可長時間使用。缺陷是交聯(lián)反映條件較激烈，酶分子各種基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失較大；顆粒較小，使用不便。共價結(jié)合法：通過共價鍵將酶蛋白分子上反映集團(tuán)與載體表面反映基團(tuán)結(jié)合，從而使酶固定化辦法。長處是結(jié)合牢固，固定化酶穩(wěn)定性好，利于持續(xù)使用，不會由于反映條件等因素容易脫落。缺陷是反映條件苛刻，操作復(fù)雜；引起高檔構(gòu)造變化，破壞活性中心，不易得到比活力高固定化酶，酶活回收率較低；底物專一性會發(fā)生變化。（3）包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化辦法稱為包埋法。長處是不與酶蛋白氨基酸殘基結(jié)合，很少變化酶構(gòu)造，酶活回收率高。缺陷是包埋時化學(xué)聚合反映，易導(dǎo)致失活，只合用于小分子底物和產(chǎn)物體系。與游離酶相比較，固定化酶性質(zhì)有哪些變化？酶活性影響：酶活性下降，反映速率下降；酶穩(wěn)定性影響：操作穩(wěn)定性提高，貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高，熱穩(wěn)定性大多數(shù)提高但有些反而減少，對分解酶穩(wěn)定性提高，pH穩(wěn)定性提高明顯優(yōu)于游離酶，對有機(jī)溶劑穩(wěn)定性提高；pH變化：變化酶空間構(gòu)象，影響酶催化基團(tuán)解離，影響酶結(jié)合基團(tuán)解離，變化底物解離狀態(tài)（酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物）；最適溫度變化：隨熱穩(wěn)定性提高，最適溫度隨之提高，少數(shù)例外最適溫度下降，活性或其她因素會改進(jìn)；底物特異性變化：專一性會發(fā)生不同限度變化，作用于小分子底物酶特異性沒有明顯變化，既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物酶特異性往往會變化；米氏常數(shù)Km變化，Km值隨載體性質(zhì)變化：Km升高，酶與底物親和力減少，帶電載體與底物之間靜電作用會引起底物分子在擴(kuò)散層和整個溶液之間不均一分布。什么是固定化細(xì)胞？什么是固定化原生質(zhì)體？固定化細(xì)胞：固定在載體上并在一定空間范疇內(nèi)進(jìn)行生命活動細(xì)胞，該細(xì)胞能進(jìn)行正常生長、繁殖和新陳代謝。固定化原生質(zhì)體：細(xì)胞產(chǎn)生許多代謝物不能分泌到胞外，細(xì)胞壁對物質(zhì)擴(kuò)散障礙是其因素之一。除去微生物和植物細(xì)胞細(xì)胞壁，就可以增長細(xì)胞膜透過性，從而使較多胞內(nèi)物質(zhì)分泌到細(xì)胞外，這個過程稱為固定化原生質(zhì)體。任意選取一種酶固定化辦法，設(shè)計一種實驗方案制備固定化α-淀粉酶。（最后大題，規(guī)定寫兩種方案）酶修飾與改造酶分子修飾概念及其意義？通過各種辦法使酶分子構(gòu)造發(fā)生某些變化，從而變化酶某些特性和功能技術(shù)過程稱為酶分子修飾。意義：提高酶活力；增強(qiáng)酶穩(wěn)定性；減少或消除酶抗原性；研究和理解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、構(gòu)成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象影響。酶分子修飾辦法有哪些，原理及優(yōu)缺陷？原理長處缺陷金屬離子置換修飾把酶分子中金屬離子換成另一種金屬離子，使酶特性和功能發(fā)生變化闡明金屬離子對酶催化作用影響；提高酶活力；增強(qiáng)酶穩(wěn)定性；變化酶動力學(xué)性質(zhì)只合用于在分子構(gòu)造中本來具有金屬離子酶大分子結(jié)合修飾運(yùn)用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶空間構(gòu)造發(fā)生某些精細(xì)變化，從而變化酶特性與功能提高酶活力；增強(qiáng)酶穩(wěn)定性；減少或消除酶蛋白抗原性需要選取適當(dāng)水溶性大分子作為修飾劑，并且須通過活化側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定辦法（普通為化學(xué)法）使酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生變化，從而變化酶分子特性與功能可用于研究酶構(gòu)造和功能；可提高酶活力，增強(qiáng)酶穩(wěn)定性和減少抗原性；可獲得自然界不存在新酶種會引起酶蛋白空間構(gòu)象變化肽鏈有限水解修飾運(yùn)用酶分子主鏈切斷和連接，使酶分子化學(xué)構(gòu)造及其空間構(gòu)造發(fā)生某些變化，從而變化酶特性與功能探測酶活性中心位置；使本來不具活力酶原顯示活性；提高酶活力；某些藥用酶可消除抗原性會引起酶蛋白空間構(gòu)象變化，需要專一性較高修飾劑氨基酸置換修飾將肽鏈上氨基酸換成另一種氨基酸，從而變化酶特性和功能提高酶活力；增強(qiáng)酶穩(wěn)定性；使酶專一性發(fā)生變化難度大，成本高，專一性差，逐個對酶分子進(jìn)行修飾操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)酶分子物理修飾在不同物理條件下，不變化酶構(gòu)成單位及其基團(tuán)，共價鍵不發(fā)生變化，只有副鍵發(fā)生某些變化和重排，來觀測理解酶特性和功能變化狀況可以理解不同物理條件下由于酶分子空間構(gòu)象變化而引起酶特性和功能變化狀況；提高酶催化活性、增長酶穩(wěn)定性或使酶催化動力學(xué)發(fā)生變化共價鍵不變化3.什么是酶原激活？舉一種例子闡明酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)？某些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時沒有活性，這些沒有活性酶前身稱為酶原,使酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚悦缸饔梅Q為酶原激活。4.與天然酶比較，酶分子修飾后性質(zhì)發(fā)生了哪些變化.？熱穩(wěn)定性：普通來說，熱穩(wěn)定性有較大提高。抗原性：比較公認(rèn)是PEG和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果比較明顯。各類失活因子抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：普通在體內(nèi)半衰期得到有效延長。最適PH：大某些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶最適PH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。5.什么是酶體外定向進(jìn)化，原理及普通流程。酶體外定向進(jìn)化，又稱實驗分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)非合理設(shè)計，它不需事先理解酶空間構(gòu)造和催化機(jī)制，通過人為創(chuàng)造特殊條件，模仿自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、重組和自然選?。?，在體外改造酶基因，并定向選取出所需性質(zhì)突變酶。原理：在待進(jìn)化酶基因PCR擴(kuò)增反映中，運(yùn)用TaqDNA聚合酶不具備3’->5’校對功能性質(zhì)，配合恰當(dāng)條件，以很低比率向目基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向選取辦法，選出所需性質(zhì)優(yōu)化酶（或蛋白質(zhì)）。從而排除其她突變體。流程：1基因選?。哼x取編碼所需蛋白質(zhì)DNA序列2突變或重組：通過易錯PCR引入隨后突變或DNAShuffling等辦法增長基因序列多樣性。3突變基因文庫構(gòu)建：將獲得突變重組基因插入到表達(dá)載體中構(gòu)建突變庫。4突變體酶表達(dá)：將載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞表達(dá)變異酶。5目基因鑒定：運(yùn)用篩選和選取辦法擬定有益特性克隆。6分離改良基因并重復(fù)上述過程，直至獲得所需性質(zhì)蛋白質(zhì)。6.酶體外定向進(jìn)化過程中產(chǎn)生隨機(jī)突變方略有哪些？什么是易錯PCR？方略：易錯PCR，DNA改組，外顯子改組，雜合酶，PCR體外隨機(jī)引起重組，交錯延伸，隨機(jī)定向突變。易錯PCR是在采用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目基因時，通過調(diào)節(jié)反映條件，如提高M(jìn)g2+濃度，加入Mn2+，變化體系中四種dNTP濃度等，然后選取或篩選需要突變體。酶非水相催化酶非水相催化類型有哪些？有機(jī)介質(zhì)中酶催化；氣相介質(zhì)中酶催化；超臨界介質(zhì)中酶催化；離子液介質(zhì)中酶催化有機(jī)溶劑介導(dǎo)非水相生物催化體系類型？非極性有機(jī)溶劑—酶懸浮體系（微水介質(zhì)體系）；與水互溶有機(jī)溶劑—水單相體系；非極性有機(jī)溶劑—誰兩相/多相體系什么是必須水？維持酶分子完整空間構(gòu)象所必要最低水量稱為必要水。有機(jī)介質(zhì)酶催化反映長處。（大題）1酶在有機(jī)介質(zhì)中由于水分子減少，相對來說酶分子構(gòu)象體現(xiàn)出比水溶液中更具備“剛性”特點。因而使通過選取不同性質(zhì)溶劑來調(diào)控酶某些特性成為也許。2由于引起沒變形許多因素都與水存在關(guān)于，因而在有機(jī)介質(zhì)中酶穩(wěn)定性得到明顯提高。3由于有機(jī)溶劑存在，水量減少，大大減少了許多需要水參加副反映，如酸酐水解，?；D(zhuǎn)移等。4在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行酶促反映，可以省略產(chǎn)物萃取分離過程，提高收率。舉例闡明有機(jī)介質(zhì)中酶催化反映詳細(xì)應(yīng)用。酶抑制劑什么是酶失活作用？什么是酶抑制作用？什么是酶去激活作用？失活作用是指由于某些物理因素或化學(xué)試劑某些或所有破壞了酶三維構(gòu)造，即引起酶蛋白變性，導(dǎo)致某些或所有喪失活性。抑制作用指某些化合物可以與酶必須基團(tuán)結(jié)合，變化必須基團(tuán)構(gòu)造和性質(zhì)，酶未發(fā)生變性，從而引起酶活性下降，甚至使酶活性完全喪失。去激活作用：某些酶只有在金屬離子存在下才有活性，去除金屬離子也會引起這些酶活性減少或喪失，去激活作用通過去除金屬離子而間接地影響酶活性。當(dāng)金屬離子去除后，底物與酶結(jié)合減少，事實上是減少了底物有效濃度。什么是不可逆抑制劑？什么是可逆抑制劑？如何區(qū)別這兩種抑制類型？不可逆抑制劑:抑制劑與酶必須基團(tuán)以共價形式結(jié)合，引起酶活性喪失。不能用透析、超濾等物理辦法解除抑制而使酶恢復(fù)活性?？赡嬉种苿阂种苿┡c酶蛋白以非共價方式結(jié)合，引起酶活性暫時性喪失。抑制劑可以通過透析等辦法被除去，并且能某些或所有恢復(fù)酶活性。區(qū)別：1物理辦法：用透析、超濾和凝膠過濾等辦法與否能除去抑制劑來鑒別可逆抑制作用和不可逆抑制作用。2動力學(xué)辦法：在測定酶活力系統(tǒng)中加入一定量抑制劑，測定酶反映初速度，以初速度和酶濃度作圖區(qū)別。什么是競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制？各自特點？競爭性抑制：某些抑制劑化學(xué)構(gòu)造與底物相似，因而能與底物競爭與酶活性中心結(jié)合，當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反映中心之外，其成果是酶促反映被抑制。特點：1競爭性抑制劑多是酶底物類似物或反映產(chǎn)物；2抑制劑與底物競爭與酶結(jié)合，多于酶活性中心同底物結(jié)合基團(tuán)結(jié)合；3底物濃度增長時，抑制作用削弱，取決于底物濃度與抑制劑濃度比例及其與酶親和力大小，可通過增長底物濃度辦法消除抑制作用；4動力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。非競爭性抑制：酶可同步與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)致酶活性下降。由于此類物質(zhì)并不是與底物競爭與活性中心結(jié)合，因此稱為非競爭性抑制。（名詞解釋）特點：1非競爭抑制劑化學(xué)構(gòu)造不一定與底物分子構(gòu)造類似；2底物和抑制劑分別獨立與酶不同部位相結(jié)合；抑制劑是與酶活性中心以外必須基團(tuán)結(jié)合而起作用；3抑制劑對酶和底物結(jié)合無影響，故底物濃度變化對抑制限度無影響；抑制作用只取決于酶濃度、抑制劑濃度和Ki大??；4動力學(xué)參數(shù)：Km值不變。Vm值減少反競爭性抑制：酶與底物結(jié)合后抑制劑才干和酶結(jié)合，反競爭性抑制作用常用于多底物反映。特點：1反競爭抑制劑化學(xué)構(gòu)造不一定與底物分子構(gòu)造類似；2抑制劑與底物可同步與酶不同部位結(jié)合；3必要有底物存在，抑制劑才干對酶產(chǎn)生抑制作用；抑制限度隨底物濃度增長而增長；4動力學(xué)參數(shù)：Km減小，Vm減少微生物來源酶抑制劑篩選普通環(huán)節(jié)？微生物分離；篩選模型建立；發(fā)酵條件擬定；抑制劑分離、鑒定當(dāng)代酶學(xué)請描述Riboz