3-03生物檢定法市公開課獲獎(jiǎng)?wù)n件省名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

生物檢定法1/29**生物檢定法定義：p103生物檢定屬生物法分析，是利用藥品對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組織、微生物等）作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性一個(gè)方法。它以藥品藥理作用為基礎(chǔ)，統(tǒng)計(jì)學(xué)為工具，選取特定試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在一定條件下比較供試品和相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品所產(chǎn)生特定反應(yīng)，經(jīng)過等反應(yīng)劑量間百分比計(jì)算，從而測(cè)得供試品中活性成份效價(jià)。2/29因?yàn)樯锊町惔嬖冢餀z定結(jié)果誤差較大，重現(xiàn)性比較差，需要控制條件較多

測(cè)定費(fèi)時(shí)、計(jì)算繁瑣。所以，生物檢定主要用于無(wú)適當(dāng)理化方法進(jìn)行檢定藥品，補(bǔ)充理化檢驗(yàn)不足。因?yàn)榭茖W(xué)技術(shù)發(fā)展，一些品種生物檢定可能被理化檢驗(yàn)代替，而一些新藥生物檢定方法又在不停建立。3/29生物檢定包含整體和離體測(cè)定整體測(cè)定：直接反應(yīng)藥品對(duì)生物綜合作用，但需要?jiǎng)游铩?/p>

需用供試品量多，耗時(shí)長(zhǎng)、精密度和靈敏度較差。離體測(cè)定：個(gè)體差異小，試驗(yàn)時(shí)間較短，精密度和敏度較高，能在一定程度上保留藥理作用特征，尤其適合用于微量激素測(cè)定，缺點(diǎn)是不一定能反應(yīng)供試品在整體作用。4/29一、生物檢定應(yīng)用范圍

1．藥品效價(jià)測(cè)定

對(duì)一些理化方法不能測(cè)定含量或理化測(cè)定不能反應(yīng)臨床生物活性藥品，可用生物檢定來(lái)控制藥品質(zhì)量。比如洋地黃、胰島素、肝素、絨促性素、縮官素等生物測(cè)定法，以

及各種抗生素微生物測(cè)定法。有些天然藥品、生物制品往往因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且往往又是由結(jié)構(gòu)類似、百分比不定各種成份組成，極難用理化方法反應(yīng)其生物活性；另一些藥品，尤其是一些激素類藥品，其結(jié)構(gòu)相近相近，而生物活性不一樣；還有些藥品雖可用理化方法測(cè)定含量，但含量完全不能反應(yīng)效價(jià)。所以這些藥品質(zhì)量控制都離不開生物檢定。5/292.體內(nèi)微量生理活性物質(zhì)測(cè)定

一些神經(jīng)介質(zhì)、激素等微量生理活性物質(zhì)，因?yàn)槠浜軓?qiáng)生理活性，在體內(nèi)濃度很低，加上體液中各種物質(zhì)干擾，極難用理化方法測(cè)定，而不少活性物質(zhì)生物判定法因?yàn)殪`敏度高，專一性強(qiáng)，對(duì)供試品稍作處理即可直接測(cè)定。6/293.中藥質(zhì)量控制

中藥成份復(fù)雜，大部分中藥有效成份還未搞清，難以用理化方法加以控制，一部分中藥可用一些以其療效為基礎(chǔ)生物測(cè)定方法來(lái)控制其質(zhì)量。7/294、一些有害雜質(zhì)程度檢驗(yàn)如農(nóng)藥殘留、熱原質(zhì)、抗生素及生化制劑中降壓物質(zhì)程度檢驗(yàn)等。8/29標(biāo)準(zhǔn)品

生物檢定法，普通需要應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品，以降低因?yàn)樯锊町愒斐稍囼?yàn)誤差，使在不一樣試驗(yàn)室中檢定同一藥品時(shí)，即使試驗(yàn)條件或影響原因不盡相同，但因?yàn)橥瑫r(shí)作用于標(biāo)準(zhǔn)品和供式品，在比檢定中這些影響原因能夠相互抵消，它們之間反應(yīng)強(qiáng)度百分比保持不變這么就大大提升了生物檢定可靠性和精密度。藥典所采取標(biāo)準(zhǔn)品：為參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)品，由中國(guó)藥品與生物制品檢定所發(fā)放，單位效價(jià)相當(dāng)于國(guó)際單位效價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)品有均勻、穩(wěn)定而持久性質(zhì)，應(yīng)存放于除去氧氣干燥器中，低溫處避光貯放。9/29效價(jià)檢定基本內(nèi)容

（一）生物反應(yīng)是生物檢定基礎(chǔ)

被測(cè)物特有生物學(xué)作用都可作為生物法分析基礎(chǔ)，比如生長(zhǎng)素含有促進(jìn)生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)同化、脂肪動(dòng)員作用，可致糖尿、血酮，影響鹽類代謝，已據(jù)之設(shè)計(jì)出各種生長(zhǎng)素生物學(xué)定量法（見書上表5-1）。10/29（二）劑量與反應(yīng)關(guān)系

生物檢定是利用藥品不一樣劑量引發(fā)生物體反應(yīng)程度改變以進(jìn)行藥品效價(jià)測(cè)定，要計(jì)算效價(jià)，首先要研究劑量與反應(yīng)之間關(guān)系。

在生物檢定中，劑量與反應(yīng)間普通都是曲線關(guān)系，可經(jīng)過各種坐標(biāo)轉(zhuǎn)換方法，使劑量與反應(yīng)間呈直線關(guān)系，即數(shù)學(xué)表示式為簡(jiǎn)單直線方程：y=a+bx，最便于處理和應(yīng)用。生物反應(yīng)基本上可分為以下兩種類型，即質(zhì)反應(yīng)和量反應(yīng)。11/29*1．質(zhì)反應(yīng)

當(dāng)一定劑量藥品注入動(dòng)物體內(nèi)后，觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)某一特定程度出現(xiàn)是否比如死或不死，驚厥或不驚厥，只有出現(xiàn)與不出現(xiàn)兩種情況，故不能用量來(lái)表示個(gè)體反應(yīng)程度，只能用一組動(dòng)物中出現(xiàn)正（或負(fù)）反應(yīng)百分率來(lái)表示，如死亡率、驚厥率，這類稱質(zhì)反應(yīng)。12/29在質(zhì)反應(yīng)中，將動(dòng)物分組，分別給以不一樣劑量，經(jīng)過調(diào)整劑量，使最大劑量組靠近但

不全部產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，最小劑量組靠近但不全部產(chǎn)生陰性反應(yīng)，則各組陽(yáng)性反應(yīng)動(dòng)物百分率隨劑量增加而遞升，劑量與反應(yīng)率之間關(guān)系是一條長(zhǎng)尾“肩斜”形曲線，如

將劑量轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)，反應(yīng)率轉(zhuǎn)換為適當(dāng)函數(shù)后則呈直線關(guān)系，常見轉(zhuǎn)換方法有概率單位

logit、角度等。13/29*2．量反應(yīng)

藥品對(duì)生物體所引發(fā)反應(yīng)伴隨藥品劑量增加產(chǎn)生量變能夠測(cè)量者，稱為量反應(yīng)比如血壓改變值，血糖濃度、組織器官重量增減，抑菌圈直徑大小等。時(shí)反應(yīng)雖有一些特殊性，但基本上仍可屬于量反應(yīng)，它是觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)某種程度出現(xiàn)所需時(shí)間，比如血液凝結(jié)時(shí)間、動(dòng)物生存時(shí)間等。14/29（三）對(duì)比檢定

生物檢定目標(biāo)是將供試品（T）和已知效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品(S)進(jìn)行效力對(duì)比，依據(jù)它們反應(yīng)程度，求供試品效力相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品效力倍數(shù)，再?gòu)闹杏?jì)算出供試品效價(jià)，所以它屬于對(duì)比檢定。15/29胰島素生物檢定法

胰島素是從哺乳動(dòng)物胰8胰島口細(xì)胞中提取一個(gè)蛋白類激素，為六方系結(jié)晶，相對(duì)分子量6000，易溶于80%乙醇和酸性水溶液，在pH2.5酸性溶液中比較穩(wěn)定。

*胰島素主要藥理作用是降低血糖，大劑量注入可引發(fā)驚厥、休克甚至死亡。16/29胰島素生物檢定法-詳細(xì)方法本品效價(jià)測(cè)定采取生物檢定法，基于其有降低血糖作用而采取小鼠血糖法、小鼠驚厥法、家兔血糖法。長(zhǎng)期有效制劑延效作用只能用血糖法。17/29肝素生物檢定法

肝素系由健康牛、豬、羊等食用動(dòng)物肺、肝、腸粘膜中提取有延長(zhǎng)凝血時(shí)間作用粘多糖類物質(zhì)，為白色或淡黃色無(wú)晶形粉末，有吸濕性，在水中易溶。本品相對(duì)分子質(zhì)量及抗凝血效價(jià)隨動(dòng)物種屬和臟器起源不一樣而有差異，相對(duì)分子質(zhì)量為6000-0，由肝肺提出肝素，每mg不得低于110U，由腸粘膜提出肝素，每mg不得低于140U。**本品在中性及微堿性中較穩(wěn)定。18/29肝素生物檢定法-詳細(xì)方法肝素生物檢定法是依據(jù)對(duì)數(shù)劑量與血凝時(shí)間對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系而設(shè)計(jì)，慣用有兔全血法，硫酸鈉兔全血法，另外還有使用牛、羊血法測(cè)定肝素效價(jià)方法。19/29抗生素微生物檢定法

因?yàn)榭股囟酁榻Y(jié)構(gòu)復(fù)雜多組分物質(zhì)，異構(gòu)體多，且不穩(wěn)定，輕易產(chǎn)生降解雜質(zhì)故各國(guó)藥典均以微生物檢定法為主要含量測(cè)定法。因?yàn)榭股厮幤丰t(yī)療作用主要是它抗菌活力，而微生物檢定法正是以抗生素抗菌活力為指標(biāo)來(lái)衡量抗生素效價(jià)一個(gè)方法。其測(cè)定原理與臨床要求相一致，能直接反應(yīng)抗生素醫(yī)療價(jià)值，所以一直是各國(guó)藥典所采取主要測(cè)定方法。

20/29微生物檢定法測(cè)定抗生素效價(jià)，普通可分為：稀釋法比濁法瓊脂擴(kuò)散法以瓊脂擴(kuò)散法應(yīng)用最為廣泛，為當(dāng)前國(guó)際上測(cè)定抗生素效價(jià)通用方法。21/29**瓊脂擴(kuò)散法-管碟法原理

瓊脂擴(kuò)散法，亦稱管碟法。系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散作用，采取量反應(yīng)平行線原理設(shè)計(jì)，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品二者對(duì)接種試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈大小，以測(cè)定供試品效價(jià)一個(gè)方法。22/29將不銹鋼小管安置在攤布特定試驗(yàn)菌瓊脂培養(yǎng)基平板上，當(dāng)小管內(nèi)加入抗生素溶液后，抗生素分子就隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球形擴(kuò)散。同時(shí)將培養(yǎng)基平板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)菌就開始繁殖。抗生素分子在瓊脂培養(yǎng)基中濃度，隨離開小管距離增大而降低。當(dāng)抗生素分子擴(kuò)散到T時(shí)間，這時(shí)瓊脂培養(yǎng)基中抗生素濃度恰高于該抗生素對(duì)試驗(yàn)菌最低抑菌濃度，試驗(yàn)菌繁殖被抑制而展現(xiàn)出透明抑菌圈。在抑菌圈邊緣處，瓊脂培養(yǎng)基

中所含抗生素濃度即為該抗生素對(duì)試驗(yàn)菌最低抑菌濃度。將已知效價(jià)抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液與未知效價(jià)供試品溶液在一樣試驗(yàn)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，比較二者抑菌圈大小。23/29因?yàn)橥|(zhì)抗生素對(duì)特定試驗(yàn)菌所得兩條劑量反應(yīng)曲線為平行直線，故可依據(jù)此原理，設(shè)計(jì)一劑量法、二劑量法及三劑量法（《中國(guó)藥典》只收載了二劑量法和三劑量法）等，從而能夠較準(zhǔn)確地對(duì)比出供試品效價(jià)。24/29**影響效價(jià)測(cè)定原因1．試驗(yàn)菌種2．培養(yǎng)基3．雙碟制備4．雙碟培養(yǎng)溫度和時(shí)間25/29生物制品效力檢定

生物制品效力，從試驗(yàn)室檢定來(lái)講，一是指制品中有效成份含量水平，二是指制制品在機(jī)體中建立自動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后所引發(fā)抗感染作用能力。對(duì)于診療用具，其效力則表現(xiàn)在診療試驗(yàn)特異性和敏感性。制品質(zhì)量，主要是從效力上表達(dá)出來(lái)。無(wú)效制品，不但沒有使用價(jià)值，而且可能給防疫、治療或診療工作帶來(lái)貽誤疫情或病情嚴(yán)重后果。所以，必須十分重視制品效力檢定，有制品必要時(shí)還要進(jìn)行人體效果觀察。26/29效力檢定方法有兩大類：一是體外測(cè)定