葡萄糖受體靶向噴酸葡胺長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備及其對(duì)高表達(dá)葡萄糖受體腫瘤細(xì)胞的靶向性研究

葡萄糖受體靶向噴酸葡胺長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備及其對(duì)高表達(dá)葡萄糖受體腫瘤細(xì)胞的靶向性研究

葡萄糖運(yùn)行1（glcose1，glut1）是誘導(dǎo)細(xì)胞葡萄糖提取的主要支撐。與正常組織相比,惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝率增高,而糖代謝率的增高與GLUT1的異常表達(dá)有關(guān)。已經(jīng)有大量的學(xué)者通過不同途徑證實(shí)多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)GLUT1。因此GLUT1有望成為一種新的惡性腫瘤標(biāo)記物。釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)具有較低的毒性和高的自旋數(shù)(7/2),是目前臨床磁共振造影(MRI)中廣泛使用的一種造影劑,本實(shí)驗(yàn)用PEG4400(Brij700)和自制的葡萄糖表面活性劑修飾包裹Gd-DTPA的脂質(zhì)體,并研究其腫瘤細(xì)胞靶向性。1儀器、試劑和儀器釓噴酸葡胺注射液(北京北陸藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)0611012);注射用大豆磷脂;膽固醇;Brij700(ALDRICH);棕櫚酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯;氨基葡萄糖鹽酸鹽(SIGMA);四丁基高氯酸胺;DMEM培養(yǎng)液(GIBCO);胎牛血清(GIBCO);前列腺癌細(xì)胞株(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院贈(zèng));高效液相色譜儀(SPD210Avp紫外檢測(cè)器,LC210AT泵);JXA-840A型掃描電子顯微分析儀(美國(guó)EPAX公司);NicompTM380/ZLS電位/粒徑測(cè)定儀(美國(guó)PSS公司)。2方法2.1聚合型變異構(gòu)互通法取氨基葡萄糖86.3mg溶于15mL二甲基亞砜(DMSO)和93μL三乙醇胺中,向其中加入4mL含棕櫚酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯283mg的氯仿溶液,此混合物避光條件下室溫?cái)嚢?8h。40℃減壓蒸發(fā)氯仿,殘留的液體冷凍干燥。干燥后的粉末分別用200mL水、50mL氯仿洗滌,然后再進(jìn)行冷凍干燥,最后獲得白色粉末。2.2采用反向蒸發(fā)法制備了四種脂質(zhì)體2.2.1油包水型乳劑的制備將磷脂、膽固醇按2∶1(W/W)比例溶于氯仿,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于25℃減壓蒸發(fā)除去氯仿,再加入氯仿溶解脂質(zhì)薄膜后,加入適量Gd-DTPA溶液,在水浴型超聲清洗機(jī)上超聲(18min左右)至混合物形成均勻的油包水型乳劑,再將混合液在25℃水浴下減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,最后充氮?dú)?4℃保存。2.2.2pegpegsd-tpa脂質(zhì)將磷脂、膽固醇、Brij700按4∶2∶3(W/W)比例溶于氯仿,其他步驟同“2.2.1”項(xiàng)下。2.2.3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器w/w將磷脂、膽固醇、NPG按6∶3∶1(W/W)比例溶于氯仿,短時(shí)超聲(20s),在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于25℃減壓蒸發(fā)去氯仿,其他步驟同“2.2.1”項(xiàng)下。2.2.4w/w比例將磷脂、膽固醇、Brij700、NPG按12∶6∶9∶2(W/W)比例溶于氯仿,短時(shí)超聲(20s),在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于25℃減壓蒸發(fā)去氯仿,其他步驟同“2.2.1”項(xiàng)下。2.3脂質(zhì)體形態(tài)觀察分別取4種脂質(zhì)體混懸液數(shù)滴,加適量PBS稀釋,掃描電鏡觀察其形態(tài)。2.4脂質(zhì)體的粒徑和分布取4種脂質(zhì)體適量,稀釋后用NicompTM380/ZLS電位/粒徑測(cè)定儀測(cè)定所制得的脂質(zhì)體的粒度及其分布和表面電位。2.5脂質(zhì)密封率的測(cè)定2.5.1水-乙腈-四丁基高氯酸銨樣品2(1)色譜條件:HypersilC84色譜柱(6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:水-乙腈-四丁基高氯酸銨(700mL∶300mL∶1.7g);流速:1.0mL·min-1;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;進(jìn)樣量20μL。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線:R=0.0004C-1.5065,r=0.9998(n=7),方法的日間和日內(nèi)RSD均小于5%。2.5.2透析液濃度測(cè)定分別精密量取4種脂質(zhì)體混懸液5mL,置適當(dāng)長(zhǎng)度的透析袋中,兩端扎緊,置200mLPBS中,4℃放置12h,換液繼續(xù)放置12h,收集透析液,高效液相法測(cè)定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,求得兩次透析液的濃度。包封率計(jì)算方法如下:包封率=(1-W游/W總)×100%。2.6濕度、水質(zhì)PC3細(xì)胞接種于常規(guī)25cm2的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基為DMEM,其中含1%非必須氨基酸和10%胎牛血清,細(xì)胞培養(yǎng)于二氧化碳培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳,相對(duì)濕度90%。取傳代后2d的細(xì)胞(處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)18瓶,隨機(jī)分為6組,每組3瓶,每組細(xì)胞總量約1.5×106,移去營(yíng)養(yǎng)液,分別加入PBS以及Gd濃度都為20mmoL·L-1的釓噴酸注射液、普通脂質(zhì)體,PEG修飾脂質(zhì)體,葡萄糖修飾脂質(zhì)體、葡萄糖PEG修飾脂質(zhì)體,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,移去脂質(zhì)體,PBS連續(xù)洗3遍,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,用胰酶消化,移入離心管中,計(jì)數(shù),離心,PBS連續(xù)洗2遍,移入1.5mLEP管內(nèi),送臨床MRI檢測(cè)。3結(jié)果3.1脂質(zhì)體的形狀、粒徑、分布和密封率掃描電鏡觀察,4種脂質(zhì)體形態(tài)圓整。包封率以及激光散射法測(cè)定Gd-DTPA脂質(zhì)體的平均粒徑和表面電位見表1。3.2細(xì)胞吸收gs-dtpa每組實(shí)驗(yàn)最后收集到的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)的MRI檢測(cè)結(jié)果見表2?？梢钥闯?PBS與Gd-DTPA注射液細(xì)胞攝取的信號(hào)值都很低,說(shuō)明Gd-DTPA注射液幾乎不被細(xì)胞攝取;Gd-DTPA脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取的信號(hào)值較高,說(shuō)明細(xì)胞對(duì)Gd-DTPA脂質(zhì)體有較好的吸收;PEG修飾的Gd-DTPA脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取信號(hào)要略低于Gd-DTPA脂質(zhì)體,但平均每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)值卻高于Gd-DTPA脂質(zhì)體;葡萄糖修飾的Gd-DTPA脂質(zhì)體以及葡萄糖PEG修飾的Gd-DTPA脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取信號(hào)值均要高于普通脂質(zhì)體和PEG修飾的Gd-DTPA脂質(zhì)體。4葡萄糖修飾可顯著提高擴(kuò)增層壓脂質(zhì)體進(jìn)入機(jī)體很容易被巨噬細(xì)胞吞噬,因此我們用PEG對(duì)包裹Gd-DTPA的脂質(zhì)體進(jìn)行修飾,從而增加其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。脂質(zhì)體本身沒有特異靶向性,必須在脂質(zhì)雙分子層上裝上歸巢裝置(homingdevices)才能具有組織特異性。常用的歸巢裝置有抗體、激素、糖殘基和受體配體等。由于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞膜上都有比較高的表達(dá),因此,與其它歸巢裝置相比,葡萄糖作為歸巢裝置具有很多優(yōu)點(diǎn),如無(wú)毒、穩(wěn)定、適用范圍廣等。因此,采用自制的葡萄糖表面活性劑NPG對(duì)PEG修飾的脂質(zhì)體進(jìn)一步修飾,得到葡萄糖受體靶向的Gd-DTPA長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明葡萄糖修飾的Gd-DTPA脂質(zhì)體以及