內(nèi)生菌與藥用植物活性成分提取的關(guān)系

內(nèi)生菌與藥用植物活性成分提取的關(guān)系

白牙，又名八角牛、野胡椒和羊澤草，是廣州科的一種多年生草本植物。根皮用藥。中藥被稱為白牙皮，具有清熱解毒、祛熱、利尿、除濕、殺蟲等功效。皮膚瘙癢、濕疹、傷口、黃疸、肝炎和陰胃瘙癢。根含生物堿，主要有白鮮堿、黃柏酮等，葉含蕓香甙、揮發(fā)油等。白鮮生于海拔200～900m之間的山坡、林下、林緣或草甸，分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、陜西、甘肅、山東、江蘇、江西、安徽、湖北等地。白鮮皮有解熱作用，對(duì)多種致病菌有不同程度的抑制作用。我國(guó)民間外用其根為止血藥，白鮮葉可提取芳香油，根莖作農(nóng)藥用，可防治多種病蟲害。目前，國(guó)內(nèi)外利用植物防治病蟲害的研究和報(bào)道較多，但對(duì)白鮮的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理活性、栽培等方面。內(nèi)生菌廣泛分布在各種植物中，近年來，從蔬菜、花卉、藥用植物等多種植物中分離到了大量?jī)?nèi)生菌，內(nèi)生菌可以調(diào)節(jié)宿主植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗性、促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的合成等。研究表明，許多內(nèi)生菌能幫助植物抵抗病蟲害提高植物的抗逆性，并已從多種植物中分離出了具有此種作用的內(nèi)生菌。植物內(nèi)生菌是個(gè)潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源?，F(xiàn)有的報(bào)道中，未發(fā)現(xiàn)白鮮內(nèi)生菌的研究，為了解白鮮內(nèi)生菌的種類及組成，采用組織分離法進(jìn)行了白鮮內(nèi)生菌進(jìn)行分離與培養(yǎng)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料2012年6月采于通化師范學(xué)院植物園的健康、無病蟲害的野生白鮮植株，用清水洗凈表面泥土后備用。1.2菌種分離、培養(yǎng)菌種分離所用培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)）；PDA培養(yǎng)基（用于真菌的分離、培養(yǎng)）；高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基（用于放線菌的分離、培養(yǎng)）。培養(yǎng)基采用濕熱滅菌法滅菌：121℃維持15～20min。1.3牛肉膏蛋白、pda及高氏號(hào)培養(yǎng)取新鮮健康的白鮮根、莖、葉，用洗衣粉清洗干凈，然后切成長(zhǎng)段，用濾紙吸干表面水分，在無菌室進(jìn)行表面消毒。無菌水沖洗2遍，用75%乙醇浸泡葉子1min，根、莖1.5min，無菌水沖洗3～4遍,再用0.1%升汞浸泡葉1min，根、莖1.5min，無菌水沖洗4～5遍。將白鮮的根和莖切成2mm的小段，葉切成5mm2的小塊，接種，每個(gè)平皿接10個(gè)外植體，每部位重復(fù)2次，同時(shí)做空白。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)24h,PDA培養(yǎng)基于28℃恒溫培養(yǎng)3～5d，高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基于28℃恒溫培養(yǎng)5～7d。純化，斜面保存菌種。觀察根、莖、葉側(cè)面或頂端的菌落形態(tài)，通過單染色和革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)并進(jìn)行鑒定。2結(jié)果與分析通過對(duì)白鮮根、莖、葉中內(nèi)生菌的分離，共分離出13種內(nèi)生細(xì)菌，其中桿菌有12種，球菌有1種，具體情況如下。2.1生物量的多樣性由表1可知，白鮮不同部位內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量有差別，莖和葉中內(nèi)生菌種類較為豐富，根中的內(nèi)生細(xì)菌種類較少，這可能是內(nèi)生菌對(duì)宿主的選擇性及適應(yīng)性所導(dǎo)致的結(jié)果。2.2革蘭氏染色分析從PDA培養(yǎng)基中分離到的內(nèi)生菌，根、莖各1種，葉2種,在顯微鏡下觀察革蘭氏染色的結(jié)果，可以判斷這些內(nèi)生菌都為細(xì)菌。而PDA培養(yǎng)基是用來分離真菌的，此試驗(yàn)未分離到真菌，可能是由于外植體消毒效果不好或是培養(yǎng)基配方不適于真菌生長(zhǎng)引起的。2.3染色細(xì)菌形態(tài)分析圖7（封三）是從高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上分離到的內(nèi)生菌，菌落形態(tài)類似放線菌，菌絲較細(xì)，無氣生菌絲，呈放射狀伸到培養(yǎng)基內(nèi)部和表面，不易挑取。單染色后，其細(xì)菌形態(tài)為桿菌，革蘭氏染色后呈陰性，通過觀察該菌的外形可以判斷這兩種菌屬于細(xì)菌。因此從高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上未分離到放線菌。3牛肉膏蛋白培養(yǎng)基中內(nèi)生細(xì)菌的分離和最佳培養(yǎng)方法植物內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，對(duì)增強(qiáng)宿主植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力具有重要意義，內(nèi)生菌與宿主植物在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過程中構(gòu)成了一種穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系。本試驗(yàn)采用組織分離法對(duì)白鮮根、莖、葉的內(nèi)生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，共分離出13種內(nèi)生細(xì)菌，其中12種桿菌，10種革蘭氏陽(yáng)性菌，2種革蘭氏陰性菌，1種球菌為革蘭氏陰性菌。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一種內(nèi)生細(xì)菌可在白鮮不同部位生長(zhǎng)。本試驗(yàn)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中分離出的細(xì)菌比較多，而PDA培養(yǎng)基和高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基中未分離出相應(yīng)的真菌和放線菌，只分離出了細(xì)菌，可能是由于外植體消毒效果不好或是培養(yǎng)基配方不適于真菌和放線菌生長(zhǎng)引起的。藥用植物體內(nèi)存在大量豐富的內(nèi)生菌，往往具有抑制病原菌、協(xié)助宿主抵抗病原菌和促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)的作用。本試驗(yàn)意外發(fā)現(xiàn)，在