第十六章-基因工程及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

第十六章基因工程及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1第一節(jié)

基因工程2目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——將體外分離或人工合成的DNA與載體DNA連接，形成重組DNA，然后轉(zhuǎn)化細(xì)菌或轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞宿主，通過篩選得到能表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，純化后，穩(wěn)定地擴(kuò)增、傳代和表達(dá)?；蚬こ痰母拍?/p>

3基因工程基本原理4基因工程操作流程①載體的構(gòu)建和選擇；②目的基因的制備；③限制性內(nèi)切酶酶切載體和目的基因形成相匹配的接口；④DNA連接酶連接載體和目的基因；⑤重組DNA轉(zhuǎn)化入細(xì)胞；⑥擴(kuò)增；⑦篩選和鑒定重組子；⑧表達(dá)，純化蛋白5基因工程載體制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進(jìn)入受體細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。

載體：指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA。6基因工程載體的一般要求①能夠自我復(fù)制，產(chǎn)生大量拷貝，裝載目的基因后使后者能得到大量擴(kuò)增；②載體DNA在提純分離中容易和宿主細(xì)胞的染色體DNA分開；③本身分子量較小，容易操作，可裝載較大分子量的目的基因；④具有多個單一限制性內(nèi)切酶酶切位點，便于目的基因的插入；⑤含有一個或多個篩選標(biāo)記，目的基因插入、轉(zhuǎn)化細(xì)菌后可以通過抗生素抗性、營養(yǎng)缺陷或顯色表型反應(yīng)等進(jìn)行篩選；⑥穩(wěn)定地在子代細(xì)胞中復(fù)制或表達(dá)。78載體分類按載體來源分為:質(zhì)粒噬菌體病毒按載體用途分為:克隆載體表達(dá)載體按載體的宿主細(xì)胞分為:原核克隆/表達(dá)載體真核克隆/表達(dá)載體91.質(zhì)粒

(plasmid)特點能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。10目錄11pUC18/1912λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）2.噬菌體(phage)M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列1314病毒載體質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細(xì)胞的載體。由于動物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用包括：如腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)入病毒載體、慢病毒載體以及用于昆蟲病毒表達(dá)的桿狀病毒載體等。15目的基因的獲取人工合成基因文庫cDNA文庫PCR擴(kuò)增16條件：已知目的基因核酸序列或蛋白質(zhì)序列。基因較小人工合成17人工合成基因的局限性長度有限密碼子兼并性二級結(jié)構(gòu)影響拼接費用較高18二、基因組文庫的構(gòu)建應(yīng)用核酸的分離純化技術(shù)，直接從生物體組織和細(xì)胞中將全部DNA提取出來，然后用限制性內(nèi)切酶隨機地將DNA酶切成20kb~40kb或更大的數(shù)以萬計的片段。將所有的片段與同一類載體連接重組，得到數(shù)以萬計的重組體，再全部轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和保存。這種含有所有DNA克隆的混合體就是基因文庫。需要制備目的基因時，可以通過探針或其他技術(shù)將所需的目的基因從基因文庫中“釣”出來。19三、cDNA文庫的構(gòu)建

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA，則此DNA序列與mRNA互補，稱為互補DNA或cDNA。提取出組織細(xì)胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。20cDNA文庫的構(gòu)建：21

22基因組含有的基因在特定的組織細(xì)胞中只有一部分表達(dá)，而且處在不同環(huán)境條件、不同分化時期的細(xì)胞其基因表達(dá)的種類和強度也不盡相同，所以cDNA文庫具有組織細(xì)胞特異性。

cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對真核細(xì)胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的DNA。23四、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

24PCR基本原理N=N0(1+e)n

25PCR反應(yīng)體系

模板（template）引物(primer)DNA聚合酶(DNApolymerase)dNTPPCRbuffer26PCR熱循環(huán)

94℃,300S

94℃,60S

30

55℃,60S

72℃,60S

（舉例）72℃,7min

27載體DNA與目的基因的連接28限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。29BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口30DNA連接酶1、大腸桿菌DNA連接酶：只能連接粘性末端2、T4DNA連接酶：既能連接粘性末端，又能連接平末端31DNA連接酶作用模式圖321.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接33BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄34不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目錄35同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。365′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄37人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

38人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄392.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端40目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄41重組DNA分子引入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染42一、轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入細(xì)胞（常指原核細(xì)胞如細(xì)菌）而使遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化。指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。43二、轉(zhuǎn)染指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子（非包裝形式）導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。44三、感染噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖就是感染（infection）。用經(jīng)人工改造的噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞，使目的序列得以復(fù)制繁殖。感染的效率很高，但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較麻煩。45重組體的篩選和鑒定46一、遺傳標(biāo)記篩選1.最常見的載體攜帶的標(biāo)志是抗藥性標(biāo)志，如抗氨芐青霉素（ampr）、抗四環(huán)素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細(xì)胞全部篩除掉了。4748(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇492.營養(yǎng)缺陷型的互補篩選二氫葉酸還原酶(DHFR)基因缺陷α互補篩選50DHFR缺