微生物法發(fā)酵豆粕工藝的研究

微生物法發(fā)酵豆粕工藝的研究

長期以來，人們對食物蛋白質(zhì)的水處理進行了研究。因為當?shù)鞍踪|(zhì)水處理后，它具有良好的分解特性，并且與母劑沒有反應(yīng)活性。其中大豆多肽是各種生物活性肽的重要來源,而利用酶對大豆蛋白進行水解也被認為是最有效的大豆多肽制備工藝。從作用的方式上來分,蛋白質(zhì)的酶水解可分為直接酶解和間接酶解。目前國內(nèi)外對多肽的制備研究主要集中在利用純酶制劑進行直接酶解,由于商品酶制劑成本高昂,直接酶解法生產(chǎn)大豆多肽代價巨大,限制了其在發(fā)展中國家的工業(yè)化生產(chǎn)。因此,基于間接酶解法的微生物發(fā)酵制備多肽的工藝,已日益受到研究人員的關(guān)注。我國近年來在此領(lǐng)域開展了較多研究,萬琦等篩選到一株能在發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶和外肽酶的枯草芽孢桿菌,利用此菌所產(chǎn)蛋白酶的作用將大豆蛋白水解成短肽,利用此菌所產(chǎn)羧肽酶的作用將短肽末端的疏水性氨基酸切除,從而實現(xiàn)了酶解和脫苦一步完成的大豆多肽發(fā)酵生產(chǎn)。邵偉等也將一株經(jīng)馴化處理的枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵制備大豆多肽;李里和潘進權(quán)等則研究了利用一株真菌為發(fā)酵菌株,通過液體發(fā)酵法來制備大豆多肽的工藝。在工業(yè)化生產(chǎn)方面,張雁平通過成本核算,認為采用發(fā)酵法生產(chǎn)大豆蛋白活性肽產(chǎn)品與酶解法相比,得率提高10%～20%,成本僅為酶解法的50%～60%。因此,該技術(shù)有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟性。本研究在前人工作基礎(chǔ)上,利用本實驗室篩選保藏的枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株,以制油工業(yè)的副產(chǎn)品-豆粕為底物,對發(fā)酵法生產(chǎn)大豆多肽的工藝進行了研究,并著重闡明發(fā)酵過程中的大豆蛋白水解和脫苦機制,為大豆活性肽的工業(yè)化低成本生產(chǎn)提供參考。1材料和方法1.1蛋白和試劑菌種Bacillus.subtilisSHZ3由本實驗室篩選保藏;豆粕(蛋白含量43.7%)南京北星牧業(yè)有限公司;苯甲氧羰-L-谷酰-L-酪氨酸(Z-Glu-Tyr)、葡聚糖凝膠(SephadexG-25)、藍色葡聚糖2000Sigma公司;Folin-酚試劑北京賽吉;其它試劑均為分析純。1.2冷凍離心系的紫外檢測FJG-0.03型發(fā)酵罐鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司;5804R型冷凍離心機Eppendorf德國公司;UV-2450型可見紫外檢測儀Shimadzu日本公司;層析系統(tǒng)上海滬西分析儀器廠。1.3方法1.3.1菌種濃度測定從活化后的菌種保藏斜面中以無菌操作挑取兩環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中,37℃,120r/min,培養(yǎng)24～36h,使菌體濃度達到108CFU/ml。(種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,胰蛋白胨1%,NaCl0.5%,pH7.2)1.3.2接種、培養(yǎng)、培養(yǎng)按5%接種量將發(fā)酵菌株種子液火焰環(huán)接種于發(fā)酵液中,37℃,攪拌通氣培養(yǎng),每隔8h取樣。(發(fā)酵培養(yǎng)基:豆粕5%,葡萄糖0.5%,自然pH)1.3.3大豆提取物的分離將發(fā)酵液于4℃,10000r/min,冷凍離心。取上清夜微孔濾膜過濾(0.45μm),濾液即為大豆多肽液混合液。1.3.4dna提取及檢測調(diào)整大豆多肽液蛋白濃度為5%(W/V),以2ml上樣體積進行凝膠層析。柱條件:SephadexG-25(2.6×100cm),流速30ml/h,每管收集5ml,檢測波長220nm,洗脫液為去離子水,分子量標品為藍色葡聚糖2000(MW2000kDa)、胰蛋白酶(233kDa)、鈷胺酰胺(VB12,1355Da)、還原谷胱甘肽(GSH)(307Da)、甘氨酸(75Da)。1.3.5分辨率測量按照文獻所述方法進行測定。1.3.6游離氨基酸含量的測定按照文獻所述方法進行茚三酮顯色測定。1.3.7大豆多肽混合液的制備多肽含量以酸可溶性多肽計,將等體積的三氯乙酸(TCA,0.4mol/L)加入到大豆多肽混合液中,靜置0.5h后以10000r/min離心10min,去除酸不溶性的蛋白和長鏈肽沉淀。用雙縮脲法測定上清夜中的多肽含量。1.3.8酶活性在發(fā)酵溶液中的測定以酪蛋白(2%)為底物,按文獻采用Folin-酚法測定,一個蛋白酶活力單位(U)定義為每小時釋放出1μg酪氨酸所需的酶量。1.3.9g酪氨酸酶活力測定以Z-Glu-Tyr(1mmol/L)為底物,按文獻采用茚三酮顯色法測定,一個羧肽酶活力單位(U)定義為每小時釋放出1μg酪氨酸所需的酶量。1.3.10.多媒體溶液的苦味評估按照文獻所述方法進行感官品質(zhì)評定。2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵過程中大豆蛋白的多肽濃度和游離氨基酸含量變化為考察發(fā)酵效率,對不同時間發(fā)酵液的水解度進行測定,結(jié)果如圖1所示。在發(fā)酵前期(0～32h),水解度隨著發(fā)酵時間的延長顯著上升,并在32h達到30%左右。而發(fā)酵后期水解度的增幅明顯趨緩,這一方面是由于在發(fā)酵后期菌體進入衰亡期,所分泌的水解酶量急劇下降,另一方面發(fā)酵體系的理化條件(如pH,底物濃度)發(fā)生了不利于水解酶活力的變化,從而使發(fā)酵后期的蛋白水解效率降低。圖2顯示了發(fā)酵過程中發(fā)酵液的多肽濃度和游離氨基酸含量的變化。其中多肽濃度呈現(xiàn)先增后減趨勢,在24h達到最高值8.2mg/ml;而游離氨基酸含量一直維持增長并在最后8h急劇上升,這表明在發(fā)酵過程中,豆粕中的大豆蛋白首先被發(fā)酵菌株分泌的肽鏈內(nèi)切的蛋白酶類水解成不同鏈長的多肽,多肽濃度累積增加;而后大豆多肽在外肽酶的作用下被進一步水解成游離氨基酸,發(fā)酵液中多肽濃度降低而氨基酸濃度顯著增加。2.2發(fā)酵液中羧肽酶的變化為進一步了解Bacillus.subtilisSHZ3發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆多肽的具體水解機制,對菌株的產(chǎn)酶動態(tài)進行了研究(圖3),并對不同時間發(fā)酵液的苦味值進行感官評定(表1)。從中可以看出在發(fā)酵液的蛋白酶,羧肽酶活力和發(fā)酵液的苦味值之間存在一定的聯(lián)系。在0～8h,菌體主要分泌蛋白酶,將大豆蛋白初步水解成長鏈肽,發(fā)酵液略有苦味;隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行(8～16h),蛋白酶將長鏈肽進一步水解成段中短鏈肽,同時在外肽酶的作用下,肽鏈內(nèi)部的疏水性氨基酸大量暴露,使得發(fā)酵液苦味激增;發(fā)酵中后期(24～32h),菌體開始大量分泌羧肽酶,其能從肽鏈的羧基末端將疏水性的氨基酸切除從而脫苦;至發(fā)酵后期(40～48h),發(fā)酵液中主要為非苦味的短鏈肽和游離氨基酸。2.3發(fā)酵過程中氨基酸多肽含量的變化為了對發(fā)酵過程中發(fā)酵液多肽分子量的大小變化進行跟蹤,利用凝膠層析對不同時間發(fā)酵液中的多肽分子量分布進行研究。從圖4可以看出,在16h時,發(fā)酵液中的多肽分子量分布主要在幾百到幾千之間,隨著發(fā)酵的進行(24h),大分子的長鏈肽逐步被酶解,含量降低,發(fā)酵液中主要為短鏈肽(Mw300～1000Da),對應(yīng)的肽鏈平均長度為3～5,而游離氨基酸的含量也大大升高。因此,在發(fā)酵中期即可得到高含量的短鏈肽。而在發(fā)酵初期(8h),發(fā)酵液中主要為大分子量的大豆蛋白和長鏈肽,而在發(fā)酵后期(48h)主要為游離氨基酸,多肽含量很低(凝膠層析數(shù)據(jù)未列)。眾多研究表明,只有短鏈的大豆多肽(3～10個氨基酸殘基)才具有特定的生物活性,因此,本工藝的發(fā)酵時間定為24h最佳。3大豆多肽的制備和直接以發(fā)酵菌株的次生代謝產(chǎn)物為產(chǎn)品的生物活性肽的生產(chǎn)不同,本研究利用微生物發(fā)酵來產(chǎn)大豆多肽主要利用的是發(fā)酵菌株的產(chǎn)酶及酶解能力。豆粕是制油工業(yè)的副產(chǎn)品,富含大豆蛋白,不僅價格低廉(約為大豆分離蛋白的十分之一),而且能提供了菌體生長所需的碳氮源和無機鹽,十分適于作為發(fā)酵底物。由本實驗室所篩選保藏B.subtilisSHZ3,能在以豆粕為主的液體培養(yǎng)基上良好生長,并在生長代謝過程中大量分泌胞外蛋白酶和羧肽酶,在發(fā)酵過程中將原料中的大豆蛋白水解并脫除苦味根源的肽鏈末端疏水性氨基酸。因此,控制好發(fā)酵的進程,便可得到具有特定鏈長和對應(yīng)功能的無苦味大豆多肽。本發(fā)酵工藝不僅與純酶水解法制備大豆多肽的工藝相比優(yōu)勢明顯