血紅蛋白的提取和分離1

血紅蛋白的提取和分離一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）凝膠色譜法：（也叫分配色譜法）根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。原理：所用凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的。在小球體內(nèi)部有許多通道，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理（二）緩沖溶液具有緩沖作用的溶液稱緩沖溶液。緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH的影響，維持PH基本不變。一般由緩沖物質(zhì)對(duì)構(gòu)成，如：H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/NaHPO4作用機(jī)制：以H2CO3/NaHCO3為例A：當(dāng)酸性物質(zhì)（如乳酸）進(jìn)入后，與溶液中的NaHCO3發(fā)生作用，生成乳酸鈉和碳酸，而碳酸可以分解成CO2和H2O，CO2排出則PH不變；B：當(dāng)堿性物質(zhì)（如碳酸鈉）進(jìn)入后，與溶液中的H2CO3發(fā)生作用，形成NaHCO3，溶液PH不變。（三）電泳1、定義：是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。2、原理：許多大分子都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)；不同分子帶電有差異，分子本身的大小、形狀不同，在電場(chǎng)中產(chǎn)生不同的遷移速度，從而可實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。凝膠電泳原理示意圖（四）血紅蛋白在紅細(xì)胞的組成中，約90%是血紅蛋白。它由四個(gè)肽鏈組成，包括兩個(gè)α—肽鏈和兩個(gè)β—肽鏈。每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色。二、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過(guò)凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放3、分離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過(guò)濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為70）透析。紅細(xì)胞的洗滌分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑無(wú)色透明的甲苯層脂類物質(zhì)白色脂溶性物質(zhì)沉淀層血紅蛋白溶液紅色透明液體紅細(xì)胞破碎物沉淀暗紅色沉淀物練習(xí)鞏固1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過(guò)程D獲得高純度的蛋白質(zhì)2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無(wú)法比較3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C