第11章氨基酸的發(fā)酵

第11章氨基酸發(fā)酵11.1概述一、氨基酸的種類氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，通常由5種元素組成，即C、H、O、N、S。在自然界中，已發(fā)現(xiàn)組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種，而這20多種氨基酸都是羧酸分子中α-C上的一個(gè)氫被氨基所取代而成的化合物，故稱α-氨基酸。二、氨基酸的應(yīng)用1、在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用2、在食品工業(yè)中的應(yīng)用3、在飼料工業(yè)中的應(yīng)用4、在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用5、在化學(xué)工業(yè)中的應(yīng)用三、氨基酸的生產(chǎn)方法1、蛋白質(zhì)水解提取法將蛋白質(zhì)經(jīng)酸堿水解后，再經(jīng)分離純化獲得各種氨基酸。2、直接發(fā)酵法

所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為主要原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,積累特定的氨基酸。20種氨基酸中有18種能用這種方法生產(chǎn)，其中產(chǎn)量最大的是谷氨酸。3、酶法利用微生物細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的酶來(lái)制造氨基酸。4、化學(xué)合成法利用有機(jī)合成和化學(xué)工程的技術(shù)生產(chǎn)和制備氨基酸5、添加前體發(fā)酵法又稱微生物轉(zhuǎn)化法。傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學(xué)合成法由于前體物的成本高，工藝復(fù)雜，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。所以現(xiàn)在生產(chǎn)氨基酸的方法多為微生物發(fā)酵法。四、氨基酸工業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀和動(dòng)態(tài)我國(guó)氨基酸工業(yè)是從20世紀(jì)60年代開始起步的，先后開展了蛋白質(zhì)水解提取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)氨基酸的研究。

目前生產(chǎn)氨基酸的大國(guó)為日本和德國(guó)。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國(guó)的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司，但目前無(wú)論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國(guó)外抗衡。在80年代中后期，我國(guó)從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進(jìn)輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品，1991年銷售量為二千萬(wàn)瓶，1996年達(dá)六千萬(wàn)瓶，主要廠家有無(wú)錫華瑞、北京費(fèi)森尤斯、昆明康普萊特，但生產(chǎn)原料都依賴進(jìn)口。到2000年，世界氨基酸產(chǎn)值達(dá)45億美元，占生物技術(shù)市場(chǎng)的7%，國(guó)內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達(dá)40億元，占全國(guó)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。11.2谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)現(xiàn)在發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)氨基酸已有20多種，已經(jīng)成為氨基酸生產(chǎn)的主要方法。在各種氨基酸的生產(chǎn)中，以谷氨酸的發(fā)酵規(guī)模、產(chǎn)量最大。11.2.1谷氨酸生產(chǎn)原料

一、谷氨酸生產(chǎn)原料谷氨酸生產(chǎn)原料有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等。

1.碳源工業(yè)上谷氨酸發(fā)酵采用的碳源一般都是淀粉原料，如玉米、小麥、甘薯、大米等，其中甘薯和淀粉最為常用。淀粉原料要先通過(guò)制糖工藝水解成微生物可直接利用的葡萄糖，然后經(jīng)過(guò)中和、脫色再投放到發(fā)酵罐。此外也可用糖蜜原料作為碳源，如甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。糖蜜因富含生物素，在發(fā)酵前需要經(jīng)活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。

2.氮源氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸及谷氨酸的原料。氮源比碳源對(duì)谷氨酸發(fā)酵影響更大，約85％的氮源被用于合成谷氨酸，另外15％用于合成菌體。一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100:（0.2～2.0），谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100:（15～21）。目前生產(chǎn)上多采用尿素或氨水作為氮源，進(jìn)行分批流加。3.無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽是微生物維持生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。其中磷酸鹽在谷氨酸發(fā)酵非常重要，它是谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中必須的，但濃度不能過(guò)高，否則會(huì)轉(zhuǎn)向纈氨酸發(fā)酵。4.生長(zhǎng)因子糖質(zhì)為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌幾乎都是生物素缺陷型，以生物素為生長(zhǎng)因子。在發(fā)酵過(guò)程中“亞適量”生物素有利于積累谷氨酸。實(shí)際生產(chǎn)中通過(guò)添加玉米漿、麩皮、水解液、糖蜜等作為生長(zhǎng)因子的來(lái)源，來(lái)滿足谷氨酸生產(chǎn)菌必須的生長(zhǎng)因子。二、淀粉水解糖的制備淀粉是由葡萄糖組成的生物大分子，大多數(shù)的微生物都不能直接利用，生產(chǎn)中都要求將淀粉進(jìn)行糖化，制備成淀粉水解糖使用。在淀粉水解糖液中，主要糖分是葡萄糖，另外尚有數(shù)量不等的麥芽糖以其他一些二糖、低聚糖等糖類少量。淀粉水解糖的制備方法有下列4種：1、酸解法（酸糖化法）它是以酸（無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。淀粉酸（催化劑）高溫高壓葡萄糖優(yōu)點(diǎn)：（1）生產(chǎn)簡(jiǎn)易，對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單。（2）水解時(shí)間短。（3）設(shè)備生產(chǎn)能力比較大。缺點(diǎn)：（1）要求有耐腐蝕、耐高溫高壓的設(shè)備。（2）副反應(yīng)的發(fā)生，造成葡萄糖的損失而使淀粉的轉(zhuǎn)化率降低。（3）淀粉顆粒大小不均造成水解不徹底。（4）淀粉乳濃度也不宜過(guò)高。2、酶解法（雙酶水解法）是用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖。此法分為兩步：淀粉液糊精及低聚糖a-淀粉酶水解糖化酶水解液化（增加淀粉的可溶性）糖化葡萄糖優(yōu)點(diǎn)：（1）酶水解反應(yīng)條件較溫和，不需要耐腐蝕、耐高溫、高壓的設(shè)備。（2）酶專一性強(qiáng)，水解副反應(yīng)少，水解糖液純度高，淀粉的轉(zhuǎn)化率高。（3）可在較高的淀粉乳液濃度下水解。（4）糖液顏色淺、較純凈、無(wú)苦味、質(zhì)量高，有利于精制。缺點(diǎn)：（1）酶水解反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般從投料到糖化完畢需2～3天時(shí)間。（2）要求設(shè)備較多。（3）需要具備有專門培養(yǎng)酶的條件。（4）糖液過(guò)濾困難。3、酸酶結(jié)合法酸酶結(jié)合水解法是集酸法和酶法制糖的優(yōu)點(diǎn)而采用的結(jié)合生產(chǎn)工藝。根據(jù)淀粉原料性質(zhì)又可分為酸酶水解法和酶酸水解法。（1）酸酶水解法淀粉糊精或低聚糖酸糖化酶葡萄糖優(yōu)點(diǎn)：（1）酸液化速度快，且用量少。（2）對(duì)液化液的要求不高。（3）可采用較高的淀粉乳濃度，以提高生產(chǎn)效率。（2）酶酸水解法淀粉乳淀粉液α-淀粉酶過(guò)濾、除雜酸水解葡萄糖優(yōu)點(diǎn)：（1）能采用粗原料淀粉。（2）淀粉濃度較酸法高，生產(chǎn)較易控制。（3）水解時(shí)間短，糖液色澤淺。（4）酸水解pH值稍高，可減少淀粉水解副反應(yīng)的發(fā)生。采用不同的水解制糖工藝，各有其優(yōu)點(diǎn)和不足。從水解糖液的質(zhì)量及降低糖耗，提高原料利用率方面考慮，雙酶法最好，其次是酸酶法，最差的是酶酸法、酸法。從淀粉水解整個(gè)過(guò)程所需的時(shí)間來(lái)說(shuō)，則酸法時(shí)間最短，雙酶法時(shí)間最長(zhǎng)。三、糖蜜原料的處理1、糖蜜的來(lái)源與特點(diǎn)

甘蔗糖廠的副產(chǎn)物甜菜糖廠的副產(chǎn)物2、糖蜜原料的處理（1）降低生物素含量：活性碳或樹脂吸附、亞硝酸破壞等（2）添加青霉素（3）添加表面活性劑等

11.2.2谷氨酸生產(chǎn)菌及擴(kuò)大培養(yǎng)一、生產(chǎn)菌經(jīng)過(guò)鑒定和命名的谷氨酸生產(chǎn)菌很多，其中主要是棒桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌。它們都有以下共同特點(diǎn)：①菌體為球形、短桿至棒狀，②無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng)，③不形成芽孢，④呈革蘭氏陽(yáng)性，⑤需要生物素做生長(zhǎng)因子，⑥在通氣條件下培養(yǎng)能產(chǎn)生谷氨酸。二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)18-24h。國(guó)內(nèi)谷氨酸發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)普遍采用二級(jí)種子培養(yǎng)的流程，即：斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐一級(jí)種子的常用培養(yǎng)基配方種子的質(zhì)量要求:鏡檢菌體健壯，排列整齊，大小均勻二級(jí)種子的活菌濃度要求達(dá)到108～109個(gè)/ml要求二級(jí)種子活力旺盛平板檢驗(yàn)，菌落淡黃色，呈半透明狀小搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，產(chǎn)酸穩(wěn)定并在高峰11.3發(fā)酵機(jī)制及工藝控制一、由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑二、葡萄糖合成谷氨酸的代謝途徑三、生物合成途徑葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP途徑）和己糖磷酸支路（HMP途徑）生成丙酮酸，再氧化成乙酰輔酶A（乙酰CoA），然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，再通過(guò)乙醛酸循環(huán)、CO2固定作用，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4＋存在的條件下，生成谷氨酸。四、谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制1、糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)：（1）對(duì)EMP和HMP途徑比例的影響（2）對(duì)糖代謝速度的影響（3）對(duì)乙醛酸循環(huán)的影響2、氮代謝的調(diào)節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，使合成的谷氨酸不轉(zhuǎn)化成其他的氨基酸和參與蛋白質(zhì)的合成。

生物素亞適量時(shí)，幾乎沒(méi)有異檸檬酸裂解酶，又由于α-酮戊二酸脫氫酶的缺失，TCA循環(huán)被阻斷，使ATP大量減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成停滯，在NH4＋適量時(shí)，合成谷氨酸并積累。3、細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié)（1）控制磷脂的合成：導(dǎo)致