第3章 蛋白質(zhì)的通性、純化和表征

第3章

蛋白質(zhì)的通性、純化和表征主要內(nèi)容蛋白質(zhì)的性質(zhì)

酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（蛋白質(zhì)的沉淀）蛋白質(zhì)分離純化

一般原則分離純化方法*****

含量測(cè)定與純度鑒定一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。酸堿性質(zhì)主要決定于肽鏈上可解離的R基團(tuán)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)電荷性質(zhì)的判斷等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)：在無(wú)鹽類干擾情況下，一種蛋白質(zhì)的質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來(lái)的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH是它的真正等電點(diǎn)，稱為等離子點(diǎn)。它是蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀1.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子大小屬于膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍。蛋白質(zhì)溶液是一種親水膠體。有水化層、雙電層——膠體系統(tǒng)相當(dāng)穩(wěn)定。具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)、不能通過(guò)半透膜。2.蛋白質(zhì)的沉淀鹽析法：中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉）—水化層不變性，除鹽后可溶解。有機(jī)溶劑沉淀法：極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、丙酮）—水化層、降低介電常數(shù)低溫下快速操作可減慢變性速度。重金屬鹽沉淀法：重金屬（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag2+)—與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)形成不溶性鹽誤服重金屬鹽：服用大量的牛乳或豆?jié){，再服用催吐劑排出體外?？墒沟鞍踪|(zhì)變性。生物堿試劑和某些酸類沉淀法：生物堿：鞣酸、苦味酸、鎢酸、碘化鉀酸類：三氯醋酸、磺基水楊酸、硝酸pH<pI，蛋白質(zhì)帶正電荷，與其生成沉淀。加熱變性沉淀法：使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層和雙電層。三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加蛋白制品的純度或比活力，以增加單位蛋白質(zhì)質(zhì)量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性（以活性蛋白/毫克蛋白表示），并希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。分離純化蛋白質(zhì)的一般程序前處理粗分級(jí)分離細(xì)分級(jí)分離結(jié)晶四、蛋白質(zhì)的分離純化方法透析和超過(guò)濾鹽溶和鹽析有機(jī)溶劑分級(jí)分離法超速離心層析（色譜）

(chromatography)***電泳

(electrophoresis)***1透析和超過(guò)濾

P33-34鹽溶：中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度。

蛋白質(zhì)吸附鹽離子后帶電彼此排斥，且與水作用增強(qiáng)。二價(jià)離子比一價(jià)離子的影響力大。鹽析：使蛋白質(zhì)沉淀。

水的活度降低，自由水變成鹽離子的水化水，蛋白質(zhì)的疏水表面暴露。去鹽后能再溶解。

2鹽溶和鹽析甲醇、乙醇和丙酮（與水互溶）：

使蛋白質(zhì)沉淀，變性。使水溶液的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)的離子化程度減弱，水化程度降低；與蛋白質(zhì)直接爭(zhēng)奪水化水。冷卻到-40℃至-60℃，不斷攪拌下加入。聚乙二醇：

水溶性非離子聚合物，脫去蛋白質(zhì)的水化層。聚乙二醇與蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)發(fā)生相互作用并在空間上阻礙蛋白質(zhì)與水相接近。3有機(jī)溶劑分級(jí)分離法4超速離心

P40沉降速度法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量沉降速度法沉降系數(shù)（s）：?jiǎn)挝浑x心場(chǎng)強(qiáng)度的沉降速度。沉降速率：把蛋白質(zhì)樣品溶液放在離心機(jī)內(nèi)的特制離心池中，在離心場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)分子將沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向（徑向）移動(dòng)，并產(chǎn)生沉降界面，界面的移動(dòng)速度代表蛋白質(zhì)的沉降速率。一種蛋白質(zhì)分子在單位離心力場(chǎng)里的沉降速度為恒定值。沉降系數(shù)單位（S）：10-13秒作為一個(gè)單位。S常用來(lái)近似地描述生物大分子的大小。蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒的沉降系數(shù)介于1×10-13到200×10-13秒的范圍。5.1基本原理：層析由流動(dòng)相和固定相組成樣品作為流動(dòng)相流過(guò)固定相各組分在兩相中分布程度不同各成分遷移率不同分離5層析（色譜）（Chromatography）

P26-27兩相：固定相（靜相）和流動(dòng)相（動(dòng)相）有效分配系數(shù)：5.2層析的分類按流動(dòng)相：氣相、液相色譜等；按操作形式不同：紙層析、薄層層析、柱層析等；按分離機(jī)制：凝膠層析、離子交換層析、親和層析、吸附層析等。5.2.1紙層析

（Filter-paperchromatography）相對(duì)遷移率

P275.2.2薄層層析

（Thin-layerchromatography）

P285.2.3柱層析

P27①凝膠過(guò)濾層析

(分子排阻層析、分子篩層析）

（Gel-filtrationchromatography）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來(lái)分離純化蛋白質(zhì)的一種方法。

P33介質(zhì)：凝膠顆粒（多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。z的分級(jí)分離范圍交聯(lián)葡聚糖——SephadexG-50（1500-30000）瓊脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺——Bio-GelP原理：②離子交換層析

（Ion-exchangechromatography）根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。介質(zhì)：離子交換樹(shù)脂溶液中的離子與樹(shù)脂上的帶電基團(tuán)進(jìn)行交換反應(yīng)；各種離子交換能力不同，與樹(shù)脂結(jié)合的牢固程度就不同；在洗脫過(guò)程中，各種離子遷移率不同，達(dá)到分離的目的。

P37茚三酮反應(yīng)：生成紫色物質(zhì)