應(yīng)激性高血壓對(duì)下丘腦腎上腺髓質(zhì)素編碼基因表達(dá)及水平的影響

應(yīng)激性高血壓對(duì)下丘腦腎上腺髓質(zhì)素編碼基因表達(dá)及水平的影響

高度緊張和適應(yīng)性是現(xiàn)代快速工作和生活環(huán)境導(dǎo)致高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和心律失常等心血管疾病發(fā)病率增加的重要原因。長(zhǎng)期精神緊張后,中樞交感興奮性增強(qiáng),使血管張力持續(xù)增加以及下丘腦-腺垂體-腎上腺功能軸活動(dòng)增強(qiáng)是應(yīng)激導(dǎo)致高血壓發(fā)病的一個(gè)重要影響因素。機(jī)體的重要防御反應(yīng)及植物神經(jīng)高級(jí)中樞-下丘腦中的多種神經(jīng)遞質(zhì)如血管緊張素Ⅱ、P物質(zhì)、去甲腎上腺素等的含量及其基因表達(dá)的變化參與了應(yīng)激性高血壓的發(fā)生發(fā)展。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)廣泛分布于植物神經(jīng)調(diào)節(jié)中樞的相關(guān)核團(tuán),其中在下丘腦呈高拷貝表達(dá)。微量注射ADM到大鼠下丘腦室旁核(PVN)可經(jīng)一氧化氮和γ-氨基丁酸途經(jīng)引起血壓下降。腦室注射ADM可引起血漿促腎上腺皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素水平明顯降低。提示下丘腦ADM參與血壓和應(yīng)激激素分泌的調(diào)節(jié),可能與應(yīng)激防御心血管反應(yīng)和血壓升高的病理過(guò)程有關(guān)。因此本研究擬通過(guò)觀察應(yīng)激性高血壓過(guò)程中ADM基因表達(dá)及蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化,初步探討長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)激及血壓持續(xù)升高對(duì)下丘腦ADM合成的影響及其可能的病理生理意義。1材料和方法1.1m-mlv和ndntpADM放射免疫試劑盒購(gòu)自美國(guó)Phoniex公司;微量快速柱式組織總RNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;M-MLV購(gòu)自美國(guó)Promage公司;OligerdT(18)和dNTP購(gòu)自上海博亞公司;Taq酶購(gòu)自MBI公司;ABC試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vector公司;3,3-二氨基聯(lián)苯胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)購(gòu)自英國(guó)BBI公司;其他試劑購(gòu)自上海試劑公司。PCR引物由上海博亞生物公司合成。1.2同籠飼養(yǎng)SD雄性大鼠58只(中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重200～220g,每6只同籠飼養(yǎng),維持每天12h正常光照,飼養(yǎng)3天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.3動(dòng)物腦損傷活性測(cè)定48只動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(n=18,體重191.5±6.2g)和應(yīng)激組(n=30,體重188.7±6.3g)。其中應(yīng)激刺激第1、5、10、15天以及停止刺激后繼續(xù)飼養(yǎng)5、10天的應(yīng)激組動(dòng)物各5只,相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組動(dòng)物各3只。在以上時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束并用尾套法測(cè)定動(dòng)物尾動(dòng)脈壓后2h,將動(dòng)物斷頭處死、取腦、切取下丘腦組織并平均分割為2份保存于低溫冰箱,分別用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)和RIA測(cè)定。另外選10只大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組(n=5,體重190.5±4.8g)和應(yīng)激組(n=5,體重187.9±5.3g)。對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)10d,不接受應(yīng)激刺激,應(yīng)激組動(dòng)物應(yīng)激刺激10d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,所有動(dòng)物用烏拉坦與α-氯醛糖混合麻醉后迅速打開胸腔,左心室插入9號(hào)滅菌針頭,快速灌注0.1%肝素生理鹽水50mL,同時(shí)剪開右心房引流血液和灌注的液體。隨后先快后慢灌注4%多聚甲醛/PBS液300mL。灌注完畢剪下大鼠頭部并置于冰上,取腦并按照相應(yīng)的解剖位置切取下丘腦。多聚甲醛、蔗糖后固定后干冰-丙酮-異戊烷速凍;-70℃保存標(biāo)本用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。1.4應(yīng)激多次刺激采用復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室自行研制的應(yīng)激刺激系統(tǒng),每天在計(jì)算機(jī)控制下隨機(jī)組合、發(fā)放噪聲(150～200dB,50ms)或噪聲加足底電擊(方波50～80mV,60ms)刺激。應(yīng)激組動(dòng)物每天給予應(yīng)激刺激2次,每次2h,間隔時(shí)間為4h。對(duì)照組動(dòng)物在相同條件下飼養(yǎng),不給予任何刺激。1.5尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定在每天第二次應(yīng)激結(jié)束后2h,尾套法測(cè)定清醒大鼠尾動(dòng)脈收縮壓,測(cè)定過(guò)程中將大鼠置于大鼠固定器中,加熱使動(dòng)物體溫穩(wěn)定于38℃～40℃后,從記錄儀監(jiān)測(cè)、記錄尾動(dòng)脈收縮壓。1.6adm編碼基因和創(chuàng)造酶鏈反應(yīng)體采用微量快速柱式組織總RNA抽提試劑盒Trizol法抽提下丘腦總RNA。抽提下丘腦RNA樣品OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間,MOPS變性凝膠電泳分析RNA完整。將抽提的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成cDNA。然后以此cDNA為摸板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的基因片斷(GAPDH為對(duì)照)。ADM上游引物為5’-CCTGATGTTATTGGGTTCG-3’,下游引物為5’-TGGCGGTAGCGTTTGACT-3’。GAPDH上游引物為5’-CCACAGTCCATGCCATCA-3’,下游引物為5’-CCACCACCCGTTGCTGTA-3’。ADM編碼基因和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為268bp和451bp。聚合酶鏈反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5min,94℃變性40s→55℃退火40s→72℃延伸40s。擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠(含0.5mg/L溴化乙啶),100V電壓下電泳,Tanon紫外可見分析裝置下拍照。采用TanonGIS2010圖像處理系統(tǒng)獲得GAPDH和目的條帶的平均積分光密度值,以目的條帶與GAPDH比值來(lái)顯示基因表達(dá)的相對(duì)變化。1.7ml冰醋酸溶液下丘腦組織稱重50mg,置于1mol/L0.75mL冰醋酸中煮沸20min后,組織勻漿,3500r/min×20min離心,取上清液-70℃保存。待樣品收集完畢,干冰運(yùn)至北京心血管研究所完成放射免疫測(cè)定。1.8免疫組織化學(xué)法檢測(cè)adm免疫陽(yáng)性在連續(xù)冰凍切片中,每10張腦片取1張,每只動(dòng)物選取5張腦片,每組5只動(dòng)物共25張腦片,按照武漢博士德公司SABC免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)下丘腦ADM免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布及應(yīng)激后的變化。陰性對(duì)照用PBS代替一抗進(jìn)行孵育。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒。實(shí)驗(yàn)獲得的染色陽(yáng)性切片經(jīng)OlympusBX5顯微鏡10倍物鏡采集圖像,各組選取的部位基本一致。圖像采用Image-proPlus5.0分析系統(tǒng)計(jì)算單位面積內(nèi)的光密度值。所得數(shù)據(jù)以光密度值代表陽(yáng)性顆粒的強(qiáng)度。1.9統(tǒng)計(jì)處理多組間比較采用方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1mmhpa的比較隨著足底電擊和噪聲應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠SBP在應(yīng)激第15天達(dá)到高峰(156.3±3.3mmHg),與對(duì)照組(114.0±2.6mmHg)比較差異顯著(P<0.01)。應(yīng)激停止后5天大鼠SBP仍繼續(xù)升高,停止刺激10天后開始下降,但仍明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明應(yīng)激性高血壓模型制備成功(表1)。2.2第10天達(dá)高峰應(yīng)激組ADMmRNA表達(dá)在應(yīng)激刺激過(guò)程中逐漸上調(diào),第5天高于對(duì)照組(0.99±0.05比0.92±0.04,P<0.05),第10天達(dá)高峰(1.26±0.04比0.92±0.04,P<0.01)。而后表達(dá)下調(diào),在應(yīng)激第15天仍高于對(duì)照組(1.00±0.04比0.92±0.04,P<0.05);應(yīng)激結(jié)束后5天表達(dá)水平雖仍高于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3比0.330.19,55與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較,ADM水平在應(yīng)激10內(nèi)逐漸增加(第1天,1.25±0.22比0.93±0.19,P<0.05;第5天,1.69±0.29比0.97±0.21,P<0.01;第10天,2.00±0.28比0.94±0.24,P<0.01)。在應(yīng)激第15天以及應(yīng)激結(jié)束后5、10天水平下降,與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(圖1)。2.4應(yīng)激對(duì)大鼠腦pvn表達(dá)的影響ADM陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的棕黃色,與背景對(duì)比明顯。ADM在下丘腦分布廣泛,應(yīng)激10天后應(yīng)激組大鼠下丘腦PVN區(qū)域ADM陽(yáng)性細(xì)胞的光密度明顯高于對(duì)照大鼠,由正常的110.21±3.10增加到127.56±3.50(P<0.01),而其他區(qū)域無(wú)明顯變化(圖2和圖3)。3應(yīng)激對(duì)大鼠腦神經(jīng)功能的影響在中樞神經(jīng)系統(tǒng),ADM主要由腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞,神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生,在丘腦和下丘腦的含量最高,以自分泌或旁分泌方式參與血壓、水鈉代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié),在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。作者以往的工作表明,大鼠接受噪聲是底電擊隨機(jī)組合刺激15d引起血壓升高的同時(shí),血漿兒茶酚胺、皮質(zhì)酮以及血糖、血脂的平行升高,是制備應(yīng)激性高血壓模型的一種有效手段。作者近期工作表明,噪聲、足底電擊隨機(jī)組合應(yīng)激15d內(nèi)大鼠延髓、中腦、下丘腦、垂體和腎上腺ADM及其受體編碼基因表達(dá)均有顯著變化。在下丘腦,ADM編碼基因表達(dá)在應(yīng)激5天后明顯上調(diào),10后達(dá)高峰,而后表達(dá)下調(diào)。但編碼大鼠ADM的cDNA有1293kb堿基序列,可編碼185個(gè)氨基酸,而不是單一編碼ADM(50～52個(gè)氨基酸)。轉(zhuǎn)錄翻譯后的185個(gè)氨基酸,即腎上腺髓質(zhì)素前體原在內(nèi)源性肽酶的作用下裂解為5個(gè)片段:信號(hào)肽、腎上腺髓質(zhì)素前體原-N端20肽、腎上腺髓質(zhì)素前體原(49-52)、ADM、腎上腺髓質(zhì)素前體原(153-185)。除信號(hào)肽外,其他肽段均有各自獨(dú)特的生物學(xué)特性。為進(jìn)一步明確噪聲、足底電擊隨機(jī)組合應(yīng)激引起下丘腦ADM編碼基因表達(dá)上調(diào)后,是否主要以ADM合成釋放增加為主,而不是其他肽段。本實(shí)驗(yàn)采用敏感的放射免疫方法測(cè)定了不同應(yīng)激時(shí)間下丘腦中ADM含量,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:應(yīng)激10天內(nèi),大鼠下丘腦ADM含量較對(duì)照組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尤其在應(yīng)激第10d最明顯。提示噪聲、足底電擊隨機(jī)組合應(yīng)激引起血壓明顯升高的同時(shí),ADM編碼基因表達(dá)上調(diào)并且轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制改變,生成產(chǎn)物主要以ADM為主有關(guān)。但也不排除ADM水平在應(yīng)激10d內(nèi)的明顯升高可能也與ADM合成后釋放減少有關(guān)。與此結(jié)果不同的是,Stachniak等報(bào)道應(yīng)用去氧腎上腺素使血壓持續(xù)升高6h后,中樞ADM編碼基因表達(dá)在各腦區(qū)無(wú)明顯變化。這可能主要與不同病理狀態(tài)下血壓升高的機(jī)制差異有關(guān)。去氧腎上腺素主要是通過(guò)收縮外周阻力血管使血壓升高,而噪聲、足底電擊隨機(jī)組合應(yīng)激致高血壓則主要與自主神經(jīng)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)改變、神經(jīng)元活動(dòng)異常導(dǎo)致交感輸出增加有關(guān)。去甲腎上腺素可促進(jìn)血管內(nèi)皮內(nèi)皮細(xì)胞分泌ADM,從而引起血管代償性擴(kuò)張。因此可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)ADM編碼基因影響較小。為進(jìn)一步明確噪聲、足底電擊隨機(jī)組合應(yīng)激過(guò)程中下丘腦ADM編碼基因表達(dá)上調(diào)以及ADM含量升高的可能病理生理意義,本研究選擇ADM編碼基因表達(dá)和ADM水平變化最明顯的時(shí)間點(diǎn)-應(yīng)激第10天,通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)應(yīng)激組和對(duì)照組大鼠下丘腦ADM免役陽(yáng)性神經(jīng)元分布進(jìn)行了定位研究。作者發(fā)現(xiàn),連續(xù)應(yīng)激10d后應(yīng)激組大鼠下丘腦室旁核ADM陽(yáng)性免疫細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加,而在其他部位變化不顯著。與本文結(jié)果相反,Shan等應(yīng)用短期束縛模型(大鼠束縛應(yīng)激1h,休息1h,而后再應(yīng)激1h,休息1h)觀察到,應(yīng)激后下丘腦PVN中ADM表達(dá)減少50%。而Khan等采用較短時(shí)間(20min)束縛應(yīng)激模型,僅在下丘腦側(cè)核發(fā)現(xiàn)ADM編碼基因表達(dá)降低。這些結(jié)果差異可能與不同的應(yīng)激方式和應(yīng)激時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。提示不同應(yīng)激狀態(tài)下,ADM在下丘腦發(fā)揮作用的核團(tuán)以及病理生理意義不同。文獻(xiàn)報(bào)道,側(cè)腦室給予ADM后引起下丘腦視上核和室旁核c-fos基因表達(dá)上