管碟法測定抗生素效價培訓(xùn)課件

目錄概述1基本原理2菌液制備3基本操作及注意事項4操作要點5檢定的影響因素61管碟法測定抗生素效價10/5/20231概述抗生素微生物檢定法是國際上通用的、經(jīng)典的抗生素效價測定方法。隨著HPLC等化學分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素效價的測定已被化學方法所替代，但由于以下原因，抗生素微生物檢定法，目前在各國藥典中仍占有重要地位。2管碟法測定抗生素效價10/5/20231.微生物檢定法可直觀、特異的反應(yīng)出抗生素藥品的抗菌活性，顯示臨床的特點。2.多組分抗生素由于不同組分生物活性的差異，化學測定結(jié)果難以準確表征組分、組成、含量和活性的關(guān)系。3.許多抗生素品種由于各種原因目前沒有適當?shù)幕瘜W分析方法表征其活性。4.同時微生物法所需的儀器設(shè)備簡單，成本低。3管碟法測定抗生素效價10/5/2023在中國藥典2010年版二部附錄Ⅺ抗生素微生物檢定法及2015版藥典中，詳細描述了管碟法和濁度法測定抗生素效價的方法，根據(jù)公司生產(chǎn)及檢測情況，主要是硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉素顆粒，采用抗生素管碟法測效價來計算含量，因此，此章主要介紹管碟法。4管碟法測定抗生素效價10/5/2023抗菌活性抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力?？股氐目咕钚酝ǔＳ眯r來表示。在臨床應(yīng)用中，抗生素的抗菌活性可準確地反應(yīng)抗生素的醫(yī)療價值。如：硫酸鏈霉素798單位/毫克青霉素G鈉1670單位/毫克5管碟法測定抗生素效價10/5/20232010版藥典二部附錄及2015版藥典，在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，測定供試品的效價。2基本原理6管碟法測定抗生素效價10/5/2023兩種互動作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴散作用；另一種是試驗菌的生長作用。當培養(yǎng)到一定時間，瓊脂培養(yǎng)基的兩種互動作用達到動態(tài)平衡時，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗菌生長受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。抑菌圈的形成7管碟法測定抗生素效價10/5/20238管碟法測定抗生素效價10/5/2023量反應(yīng)平行線原理：當抗生素濃度的對數(shù)劑量和反應(yīng)呈直線關(guān)系，且供試品和標準品的作用性質(zhì)相同時，供試品和標準品的兩條量-反應(yīng)關(guān)系曲線相互平行。（中國藥典二部附錄XIV生物檢定統(tǒng)計法）9管碟法測定抗生素效價10/5/2023根據(jù)中國藥典2010年版二部附錄要求，硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉素顆粒測效價，選取短小芽孢桿菌作為試驗菌。取短小芽孢桿菌[CMCC(B)63202]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在35～37℃培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鐘，備用。3菌液制備10管碟法測定抗生素效價10/5/202311管碟法測定抗生素效價10/5/2023流程圖凍干菌粉

營養(yǎng)肉湯半固體瓊脂斜面制菌懸液穿刺管（保藏及傳代用）備注：每經(jīng)過一次培養(yǎng)箱培養(yǎng)，菌的代數(shù)就增加一代。參考：《藥品微生物學檢驗技術(shù)》主編：蘇德模馬緒榮2007年出版（復(fù)活）12管碟法測定抗生素效價10/5/20231.復(fù)活從菌種保藏機構(gòu)購回的標準菌株，是冷凍干燥粉，需經(jīng)過復(fù)活。（凍干菌種為第0代）13管碟法測定抗生素效價10/5/2023無菌操作，將冷凍干燥菌種安瓿用75%乙醇消毒后，用砂輪在安瓿頸部刻線，用無菌紗布掰開，或灼熱安瓿頂部，立即作滅菌濕紗布蓋住頂部，安瓿頂部便驟然裂開，小心移去玻璃碎片，用一無菌毛細管吸取0.5-1ml適宜的液體培養(yǎng)基，直插安瓿底部，擠出營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在底部振搖使菌粉溶解，再將安瓿內(nèi)菌液吸出，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。35-37度培養(yǎng)18-24小時。（此為第一代）14管碟法測定抗生素效價10/5/2023制保藏用菌株將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用接種針沾取菌苔（菌液），沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺。穿刺到保藏管中，同樣溫度35-37度，培養(yǎng)18-24h，然后，放置2-8度冰箱保存，作為保藏及傳代用的菌株。15管碟法測定抗生素效價10/5/2023試驗用菌種穿刺管1支，按無菌操作要求，接種于盛有30ml普通瓊脂培養(yǎng)基的大三角瓶中，旋轉(zhuǎn)三角瓶使全部瓊脂培養(yǎng)基表面被菌液浸潤，多余的菌液用吸管吸出棄入消毒液中。將已接種的三角瓶置35～37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10天，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上，用滅菌水20ml洗下芽孢，制成懸液，在65℃水浴中加熱30分鐘，即得。置5℃冰箱中保存。制工作用菌懸液16管碟法測定抗生素效價10/5/2023革蘭染色法具體操作步驟：⑴涂片⑵干燥（自然干燥、培養(yǎng)箱內(nèi)）⑶固定（火焰）⑷染色（包含初染、媒染、脫色、復(fù)染四步）17管碟法測定抗生素效價10/5/2023涂片18管碟法測定抗生素效價10/5/2023染色初染：草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘，自來水沖洗。媒染：加碘液覆蓋涂面染1分鐘，自來水沖洗。脫色：加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后自來水沖洗。復(fù)染：加沙黃（復(fù)紅）復(fù)染液30秒后，自來水沖洗。自然干燥或用吸水紙吸去水分，鏡檢。染色的結(jié)果：革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌呈紅色。19管碟法測定抗生素效價10/5/2023圖片染色步驟涂片鹽水95%乙醇自然干燥媒染1min脫色

30s固定初染1min復(fù)染30s干燥

鏡檢接種環(huán)草酸銨結(jié)晶紫碘液復(fù)紅20管碟法測定抗生素效價10/5/2023革蘭染色原理由于細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同，將細菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。⑴G＋菌：細胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性孔障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障縮小，透性降低,故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物不易被洗脫而保留在細胞膜上，菌體呈紫色為革蘭陽性菌。⑵Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，細胞壁透性加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細胞壁，沙黃復(fù)染后菌體呈紅色為革蘭陰性菌。21管碟法測定抗生素效價10/5/2023革蘭染色注意事項1.革蘭染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭陰性菌；如脫色時間過短，革蘭陰性菌也會被誤認為是革蘭陽性菌。因此必須嚴格把握脫色時間。2.選用培養(yǎng)18～24小時菌齡的細菌為宜，若細菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性菌。22管碟法測定抗生素效價10/5/2023革蘭染色結(jié)果23管碟法測定抗生素效價10/5/2023革蘭染色結(jié)果24管碟法測定抗生素效價10/5/2023管碟法的操作步驟預(yù)試驗試驗準備雙碟的制備供試品、標準品溶液的制備菌層的制備放置小鋼管滴加抗生素溶液雙碟的培養(yǎng)抑菌圈的測量結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定4基本操作及注意事項25管碟法測定抗生素效價10/5/2023預(yù)試驗：確定最佳的試驗條件：調(diào)整試驗菌的濃度、使用量、抗生素濃度、培養(yǎng)基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定，即二劑量法高劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在18～22mm,三劑量法中間劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在15～18mm.

高低劑量之比為2:1.26管碟法測定抗生素效價10/5/2023試驗結(jié)果中抑菌圈直徑不應(yīng)該過大或者過小，在試驗之前，可以先做一個關(guān)于用不同濃度菌液配制的瓊脂培養(yǎng)基菌層預(yù)試驗，選擇抑菌圈直徑在18～22mm的菌液濃度為試驗用濃度（菌液濃度約為106個/mL）。批量試驗中后期，菌液保存的時間過久，菌株就會逐漸衰亡，生長周期不一致，影響其對抗生素的敏感度，導(dǎo)致抑菌圈變大、模糊或者出現(xiàn)雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣的結(jié)果。因此，菌液在使用一段時間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數(shù)。27管碟法測定抗生素效價10/5/2023試驗準備：雙碟、鋼管、毛細滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準備、半無菌間的紫外消毒等.

28管碟法測定抗生素效價10/5/2023抗生素試驗中，玻璃雙碟、小鋼管往往會連續(xù)使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗中的抗生素（慶大霉素、爭光霉素、鏈霉素等）或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精、去污粉等）污染，以至于在下次試驗中造成抑菌圈不正常的現(xiàn)象。因此，在清洗時要尤為注意多用流水沖洗。29管碟法測定抗生素效價10/5/2023雙碟的制備：每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml,待培養(yǎng)基凝固后,將雙碟放入35～37℃培養(yǎng)箱中,待用.30管碟法測定抗生素效價10/5/2023無菌室工作臺面可能因為使用時間已久，變得凹凸不平或者傾斜，會影響培養(yǎng)基菌層的厚度均勻性。菌層越薄，形成的抑菌圈越大，會給試驗造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板，保證雙碟放置區(qū)域的平整。在雙碟底部預(yù)先標記樣品的高低濃度區(qū)域，在加注培養(yǎng)基底層的時候，有順序地按照一致方向排列。接下來加注培養(yǎng)基菌層的時候，仍然按照原來的位置與方向排列。這樣，即使桌面不夠水平，還是能夠保證培養(yǎng)基菌層是在水平的培養(yǎng)基底層上鋪開，達到消除誤差的目的。31管碟法測定抗生素效價10/5/2023試驗中加注的培養(yǎng)基如果溫度太低，就容易在內(nèi)部結(jié)塊，或者加注到雙碟之后不能及時鋪開，使得培養(yǎng)基表面為非水平面，會給試驗帶來誤差。加注60～80℃的培養(yǎng)基底層之后，不應(yīng)立即給雙碟加蓋。因為溫度過高的培養(yǎng)基會形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經(jīng)凝固定的培養(yǎng)基底層上，會給培養(yǎng)基菌層的加注帶來影響。32管碟法測定抗生素效價10/5/2023供試品、標準品溶液的制備：估計供試品的效價,根據(jù)試驗要求設(shè)計供試品、標準品溶液稀釋步驟,平行制備供試品、標準品相關(guān)劑量的溶液.依公司產(chǎn)品，硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉素顆粒，采用的是二劑量法，試驗中，制成高、低濃度的溶液。依中國藥典2010版及2015版二部附錄要求，33管碟法測定抗生素效價10/5/2023菌層的制備：注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量,注意制備菌層的速度和平整度.

34管碟法測定抗生素效價10/5/2023制備瓊脂培養(yǎng)基菌層時，培養(yǎng)基溫度過高或者受熱時間太長都會導(dǎo)致試驗菌死亡。當菌種為非芽孢桿菌的時候，現(xiàn)象尤為明顯，甚至會出現(xiàn)無菌生長。因此，培養(yǎng)基應(yīng)放在50℃水浴中保溫。當加入試驗菌種混勻后，應(yīng)盡快加注到底層培養(yǎng)基上。在試驗的時候，如果從大瓶內(nèi)用刻度吸管吸取帶菌培35管碟法測定抗生素效價10/5/2023養(yǎng)基吸管中培養(yǎng)基量少極易冷卻，加在底層培養(yǎng)基上就不易均勻鋪開，導(dǎo)致菌層厚度不均，影響到抑菌圈的直徑。因此可以事先把配制好的培養(yǎng)基分裝在具塞試管內(nèi)，每管5mL，濕熱滅菌后放在50℃水浴鍋內(nèi)保溫(水浴溫度：細菌為48~50℃，芽孢可至60℃)。試驗中，再分別加入菌液混勻，配制成帶菌瓊脂。震蕩混勻后繼續(xù)保溫5min使培養(yǎng)基溫度回升，然后直接倒在底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動雙碟使培養(yǎng)基均勻鋪開。36管碟法測定抗生素效價10/5/2023放置小鋼管放置小鋼管時，注意管與管之間不能太靠近，否則會引起相鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區(qū)中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因為液面浸潤作用，邊緣的瓊脂培養(yǎng)基菌層為非平面，會影響抑菌圈的形狀。37管碟法測定抗生素效價10/5/2023小鋼管放置時，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的方法。放置之后，不能隨意移動，要靜置5min，使之在瓊脂內(nèi)稍下沉降穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。38管碟法測定抗生素效價10/5/2023滴加抗生素溶液：注意標準品、供試品高、低劑量溶液滴加順序,保證滴加速度和加量的均勻一致.滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二劑量法）或者SH→TH→SM→TM→SL→TL（三劑量法）的順序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖洗3次。在滴加抗生素到小鋼管的時候，由于毛細管內(nèi)抗生素溶液往往會有氣泡或者毛細管開口端有液體殘留，繼39管碟法測定抗生素效價10/5/2023續(xù)滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養(yǎng)基表面造成破圈。因此一旦毛細管中出現(xiàn)氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進行滴加，毛細管口應(yīng)避免太細，滴加的時候離開小鋼管口距離不要太高。40管碟法測定抗生素效價10/5/2023TH樣品的高濃度SH標品的高濃度SL標品的低濃度TL樣品的低濃度41管碟法測定抗生素效價10/5/2023滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現(xiàn)抗生素溶液滴入小鋼管后，沒有與瓊脂培養(yǎng)基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養(yǎng)基之間，這樣是不會產(chǎn)生抑菌圈的。此時可以小心的用滴管吸出小鋼管內(nèi)的抗生素溶液，棄去。換滴管重新滴加?？股厝芤旱渭雍?，液面應(yīng)該與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴計算，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過滿，可以用無菌濾紙片小心吸去多余部分。42管碟法測定抗生素效價10/5/2023雙碟的培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),培養(yǎng)箱中水平碟放的雙碟數(shù)以不超過三層為宜。滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動，要輕拿輕放。在搬運到培養(yǎng)箱的過程中，可以預(yù)先在培養(yǎng)箱中墊上報紙鋪平，再把雙碟連同墊于桌上的玻璃板小心運至培養(yǎng)箱，緩慢推入箱內(nèi)。雙碟在37℃下培養(yǎng)約16h。時間太短會造成抑菌圈模糊，太長則會使菌株對抗生素的43管碟法測定抗生素效價10/5/2023敏感性下降，在抑菌圈邊緣的菌繼續(xù)生長，使得抑菌圈變小。在培養(yǎng)過程中，如果溫度不均勻（過于接近熱源），會造成同一雙碟上細菌生長速率不等，使抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養(yǎng)箱時，要與箱壁保持一定的距離，雙碟疊放也不能超過3個。培養(yǎng)中，箱門不得隨意開啟，以免影響溫度。應(yīng)經(jīng)常注意溫度，防止意外過冷過熱。44管碟法測定抗生素效價10/5/2023抑菌圈的測量：抑菌圈測量儀的使用,每組試驗雙碟應(yīng)在相同的測量參數(shù)下進行測量.硫酸慶大霉素顆粒劑，采取每組12只，同時做一份平行樣品，共做2組，試驗后，剔除部分不合格品。45管碟法測定抗生素效價10/5/2023采用抑菌圈自動測量分析儀ZY-300IV型，自動掃描出抑菌圈，測出直徑并計算出產(chǎn)品效價。（中國藥典2010版附錄XIV生物檢定統(tǒng)計法）46管碟法測定抗生素效價10/5/202347管碟法測定抗生素效價10/5/202348管碟法測定抗生素效價10/5/202349管碟法測定抗生素效價10/5/202350管碟法測定抗生素效價10/5/202351管碟法測定抗生素效價10/5/202352管碟法測定抗生素效價10/5/2023結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定：抑菌圈測量儀提供計算結(jié)果.如低于估計效價的90%或高于估計效價的110%時，應(yīng)調(diào)整其估計效價，重新試驗。除另有規(guī)定外，本法的可信限率不得大于5%。53管碟法測定抗生素效價10/5/20231.試驗菌需新鮮培養(yǎng)，傳代最好不超過5次,以防止菌種老化變異.芽孢桿菌培養(yǎng)物用滅菌水洗下后,應(yīng)在65℃加熱30分鐘,使菌體的菌齡一致,用革蘭氏染色,應(yīng)有芽孢85%以上.2.加入菌懸液的體積,一般不少于0.3ml,并且不大于上層培養(yǎng)基體積的2%.如果加入菌懸液的體積過小,則在同次實驗中,不同次加入菌懸液的體積相差較大,造成實驗誤差；如果加入菌懸液的體積過大,則會使上層培養(yǎng)基變稀,并且因菌懸液的溫度較低,加至培養(yǎng)基5操作要點54管碟法測定抗生素效價10/5/2023中可能造成培養(yǎng)基結(jié)塊,影響測定結(jié)果.對于加入菌懸液體積的控制,可通過調(diào)節(jié)菌懸液的濃度來實現(xiàn).

3.放置孵箱培養(yǎng)時排放應(yīng)不得超過三層,避免因培養(yǎng)溫度不均勻而導(dǎo)致各雙碟中抑菌圈大小不一.

4.在制備菌層培養(yǎng)基時,將菌液加入菌層培養(yǎng)基后,立即充分搖勻,但應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡.

5.標準品與供試品溶液濃度的比值應(yīng)控制在±2%以內(nèi)，以保證兩者的濃度偏差在一定的范圍內(nèi)。55管碟法測定抗生素效價10/5/20236.培養(yǎng)基的PH值對試驗結(jié)果影響很大，使用時培養(yǎng)基的PH值應(yīng)調(diào)節(jié)到適合該品種試驗的最佳范圍。對氨基糖苷類堿性抗生素而言，在偏堿性條件下抗菌活性比較強，通常滅菌后的PH值范圍為7.8-8.0。如抑菌圈清晰，當圈偏小時，可考慮把培養(yǎng)基的PH值調(diào)高至8.0.56管碟法測定抗生素效價10/5/20231.試驗菌種：當試驗菌種中含有對抗生素敏感度不同的兩種或兩種以上的菌株時，由于各菌株的最低抑菌濃度不同，在形成抑菌圈時可能出現(xiàn)雙圈及邊緣模糊不清，影響測量抑菌圈的準確度。因此，應(yīng)定期將試驗菌種進行平板分離，經(jīng)涂片鏡檢后，挑選典型的單個菌落作為工作用菌種。陳舊的試驗菌培養(yǎng)物也會使抑菌圈邊緣模糊，故試驗時應(yīng)用新鮮制備的試驗菌液。6檢定的影響因素57管碟法測定抗生素效價10/5/20232.培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的質(zhì)量對抑菌圈的大小和清晰度都有影響，故對配制培養(yǎng)基用的幾種主要原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及瓊脂等都應(yīng)通過預(yù)試驗選擇適宜的品種使用。慶大霉素檢定用的培養(yǎng)基是Ⅰ號。58管碟法測定抗生素效價10/5/20233.雙碟的制備：鋪雙碟底層培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的溫度不宜過高，一般將融化后的培養(yǎng)基在室溫冷至約70℃時加入雙碟中為宜，否則加雙碟蓋后，底層培養(yǎng)基上會出現(xiàn)冷凝水。當鋪菌層培養(yǎng)基時，由于冷凝水的局部冷卻和稀釋作用，可使菌層培養(yǎng)基凝固后表面不平。菌層培養(yǎng)基一定要鋪均勻，這是決定抗生素效價測定的關(guān)鍵。故要求鋪菌層時一定要與鋪底層時雙碟的位置、方向相一致。制備菌層時，培養(yǎng)基的溫度不要過高，受熱時間也不宜過長，特別是一些對熱敏感的試驗菌更要注意。否則，可使試驗菌部分或全部被殺死，導(dǎo)致抑菌圈破裂或甚至無抑菌圈形成。因此，一定要按規(guī)定控制菌層培養(yǎng)基的溫度。59管碟法測定抗生素效價10/5/2023在雙碟培養(yǎng)基上放置小鋼管的距離要合適。當距離太小而抑菌圈又太大時，則相鄰兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區(qū)中抗生素的濃度增大，形成互相影響的卵圓形或橢圓形抑菌圈。在滴加抗生素溶液至小鋼管時，若毛細滴管口不圓整或有小缺口，或管內(nèi)有氣泡，均可使抗生素溶液從管口濺出；若加液太滿，溶液會從小鋼管口溢出；小鋼管底部不平，溶液會從底部漏出。以上原因均會造成抑菌圈不圓整或破裂成桃形。防止的辦法是滴管口要圓整，管口不能太細，管內(nèi)不能有氣泡，加液時滴管口離校鋼管的距離不能太高，小鋼管兩端面要平。60管碟法測定抗生素效價10/5/20234.雙碟的培養(yǎng)溫度和時間：培養(yǎng)箱的溫度要均勻，每組雙碟要放在同一層盤內(nèi)，在培養(yǎng)過程中，不要開啟培養(yǎng)箱，以免影響培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度。雙碟的培養(yǎng)時間也與抑菌圈的清晰度有關(guān)。5.抗生素污染：無抑菌圈形成的原因，大多由于抗生素污染所致。因此，在進行抗生素效價測定時，要嚴防抗生素污染。防止的辦法是將配置和稀釋抗生素溶液所用的容器與制備培養(yǎng)基所用的容器嚴格分開，切不可將抗生素溶液撒于地面，以免抗生素附著在微小塵埃上隨風飄落在雙碟瓊脂培養(yǎng)基上，而造成抑菌圈破裂或無抑菌圈形成。61管碟法測定抗生素效價10/5/20236.標準品：抗生素微生物檢定發(fā)的實驗采用標準品與供試品對比試驗的平行線原理。因此，要求標準品與供試品必須是同質(zhì)的抗生素。如標準品與供試品所含的活性物質(zhì)不同，則標準品和供試品的兩條劑量反應(yīng)線不成平行直線關(guān)系，就不能按平行線原理計算效價。各種抗生素都有它同質(zhì)的標準品，決不能用這一型抗生素組分制備的標準品，去測定另一型抗生素的供試品。62管碟法測定抗生素效價10/5/20237.抑菌圈質(zhì)量的控制（1）抑菌圈的性狀試驗中，常有抑菌圈破裂，不圓，甚至破圈的情況，其原因是多方面的：在滴加抗生素溶液時，藥液濺出、毛細滴管碰到鋼管壁使抗生素溶液漏出，出現(xiàn)不圓等；雙碟、鋼管、鋼管放置器內(nèi)有殘留抗生素污染；試驗菌菌齡過老，菌層培養(yǎng)基加菌液時培養(yǎng)基溫度過高，將檢定菌燙死等；