我國(guó)低分子肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的修訂

我國(guó)低分子肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的修訂

素素是一種廣泛使用的抗凝劑，屬于高度硫酸的糖胺聚糖。2008年以來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)肝素類產(chǎn)品的質(zhì)量及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題十分關(guān)注,歐洲和美國(guó)藥典幾次修訂了肝素鈉的藥典標(biāo)準(zhǔn),《中國(guó)藥典》2010年版也對(duì)肝素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了大幅提高。2009年和2010年連續(xù)2年的全國(guó)藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)結(jié)果表明,目前我國(guó)市場(chǎng)上的肝素鈉注射液質(zhì)量是可靠的。低分子肝素(low-molecular-weightheparin,LM-WH)是由肝素分級(jí)或降解得到具有較低相對(duì)分子質(zhì)量的組分或片段,其抗血栓作用優(yōu)于肝素,生物利用度高、出血傾向小,是肝素的第二代產(chǎn)品。2011年LMWH注射劑評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)暴露出我國(guó)LMWH產(chǎn)品質(zhì)量及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)都存在一些問(wèn)題,多批產(chǎn)品相對(duì)分子質(zhì)量與活性不合格,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)外原研廠家的差距較大?？鼓幨袌?chǎng)銷售額逐年上升,國(guó)內(nèi)有多家企業(yè)同時(shí)進(jìn)行新藥申報(bào),市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈,對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求高。LMWH已于2012年進(jìn)入我國(guó)基本藥物目錄,是《中國(guó)藥典》2015年版?zhèn)溥x品種,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高工作迫在眉睫。根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)國(guó)藥典綜發(fā)210號(hào)文的要求,由中國(guó)食品藥品檢定研究院承擔(dān)LMWH的標(biāo)準(zhǔn)提高工作。首先全面梳理了LMWH國(guó)內(nèi)外產(chǎn)品及標(biāo)準(zhǔn)情況。由于生產(chǎn)工藝不同,每種LMWH的相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布、糖鏈末端結(jié)構(gòu)、糖鏈上取代基的數(shù)目和位置、抗凝活性有所不同,所以LMWH是一類產(chǎn)品,而不是一個(gè)產(chǎn)品。目前國(guó)外上市的LMWH產(chǎn)品有幾十種,我國(guó)進(jìn)口的有5種(達(dá)肝素鈉、依諾肝素鈉、那屈肝素鈣、帕肝素鈉、瑞肝素鈉)。從1998年到2014年5月,我國(guó)共批準(zhǔn)了15個(gè)廠家的15個(gè)原料生產(chǎn)文號(hào),18個(gè)廠家的48個(gè)注射劑生產(chǎn)文號(hào)。由于LM-WH是多糖鏈混合物,結(jié)構(gòu)具有不均一性,所以LMWH屬于生物仿制藥(biosimilar)。《英國(guó)藥典》(BritishPharmacopoeia,BP)是最早收載LMWH的藥典,從1993年版的1994年增補(bǔ)本開(kāi)始收載,BP2013年版收載了LMWH總則和5種生產(chǎn)工藝的LM-WH各論(達(dá)肝素鈉、依諾肝素鈉、那屈肝素鈣、帕肝素鈉、汀肝素鈉),總則是對(duì)LMWH產(chǎn)品的最低要求,比如重均相對(duì)分子質(zhì)量在8000以下,小于8000的級(jí)分不少于60%,抗FⅩa與抗FⅡa活性比不小于1.5等,各論中對(duì)不同工藝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量、活性、雜質(zhì)有更嚴(yán)格的要求,不同種類的LMWH應(yīng)在滿足總論要求的基礎(chǔ)上,符合各論項(xiàng)下的規(guī)定。除5種工藝的LMWH原料標(biāo)準(zhǔn)外,BP2013年版還收載了達(dá)肝素鈉注射液、依諾肝素鈉注射液、汀肝素鈉注射液?！稓W洲藥典》8.0版(EuropeanPharmacopoeia,EP)收載BP的原料藥標(biāo)準(zhǔn)。《美國(guó)藥典》(theUnitedStatesPharmacopeia,USP)從2008年第31版(USP31/NF26)第二增補(bǔ)本開(kāi)始收載依諾肝素鈉及其注射液,最新版為2014年的第37版(USP37/NF32),《日本藥典》(JapanesePhamacopeia,JP)從2006年第15版(JPⅩⅤ)開(kāi)始收載帕肝素鈉,最新版為2011年的第16版(JPⅩⅥ)。我國(guó)LMWH產(chǎn)品執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)主要是2005年新藥試行標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)正時(shí)建立的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[WS1-(X-149)-2005Z等]及2005年以后審批的企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)的LMWH產(chǎn)品基本達(dá)到了BP對(duì)LMWH的最低要求,但由于沒(méi)有按生產(chǎn)工藝對(duì)LMWH進(jìn)行分類管理,國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)外藥典和原研廠家的標(biāo)準(zhǔn)比較,在結(jié)構(gòu)表征、相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布、抗FⅩa與抗FⅡa活性、雜質(zhì)檢查等方面項(xiàng)目設(shè)置不全面,限度較寬。向國(guó)內(nèi)LMWH生產(chǎn)廠家及進(jìn)口原研廠家征集了樣品與資料,共收到11個(gè)廠家的27批原料藥,13個(gè)廠家的49批注射劑,未生產(chǎn)的企業(yè)提供了技術(shù)資料。根據(jù)企業(yè)申報(bào)資料,國(guó)產(chǎn)LMWH生產(chǎn)工藝主要有3種:由亞硝酸降解得到的達(dá)肝素鈉、由亞硝酸降解后選擇性去除大部分相對(duì)分子質(zhì)量小于2000的糖鏈而獲得的那屈肝素鈣、對(duì)肝素芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得的依諾肝素鈉。在原有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,針對(duì)不同工藝LM-WH的特點(diǎn),分別制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),增加對(duì)末端結(jié)構(gòu)的確證、增加工藝雜質(zhì)及降解雜質(zhì)檢查項(xiàng)、更嚴(yán)格的控制相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布、抗FⅩa與抗FⅡa活性比等項(xiàng)目限度,全面完善和修訂我國(guó)低分子肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),共擬定了8個(gè)標(biāo)準(zhǔn),包括達(dá)肝素鈉、達(dá)肝素鈉注射液、注射用達(dá)肝素鈉、那屈肝素鈉、那屈肝素鈉注射液、注射用那屈肝素鈣、依諾肝素鈉、依諾肝素鈉注射液,標(biāo)準(zhǔn)草案將在國(guó)家藥典委員會(huì)網(wǎng)站上進(jìn)行公示,筆者僅介紹標(biāo)準(zhǔn)研究工作中重要項(xiàng)目的起草依據(jù)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1儀器和試劑盒1.1fa酶標(biāo)儀測(cè)定faaLC-20AD型高效液相色譜儀,包括:SPD-20A紫外檢測(cè)器(日本島津公司,1,6-脫水衍生物測(cè)定用);2695高效液相色譜儀,包括:2489紫外檢測(cè)器,2414示差折光檢測(cè),Empower3工作站(美國(guó)Waters公司,相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布、苯甲醇測(cè)定用);DAWNHELEOS-Ⅱ十八角激光光散射儀,OptilabrEX干涉型示差檢測(cè)器(美國(guó)懷雅特公司,相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定用);SpectraMAX190型酶標(biāo)儀(美國(guó)MolecularDevices公司,抗FⅩa與抗FⅡa活性測(cè)定用);ICS3000離子色譜儀,包括:安培檢測(cè)器AD25(亞硝酸根測(cè)定用),電導(dǎo)檢測(cè)器(游離硫酸根測(cè)定用)(美國(guó)戴安公司);6890氣相色譜儀,包括氫火焰離子檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司,殘留溶劑測(cè)定用);雷磁DJS-1C型電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司,硫酸根與羧酸根摩爾比測(cè)定用);SpherisorbS5SAX(4.0mm×250mm,5μm)(美國(guó)Waters公司,1,6-脫水衍生物測(cè)定用);TSK-GELG2000SWxl凝膠色譜柱(7.5mm×30cm,5μm)(日本TOSOH公司,相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定用);CarboPacPA1保護(hù)柱(4mm×50mm)(賽默飛世爾科技公司,亞硝酸鹽測(cè)定用);HIBARC8柱(4.6mm×15mm,5μm)(默克公司,苯甲醇測(cè)定用);DB624毛細(xì)管柱(0.53mm×30m,3μm)(安捷倫公司,甲醇、乙醇、二氯甲烷測(cè)定用);INNOWaxPolyethyleneGlycol毛細(xì)管色譜柱(0.53mm×30m,1μm)(安捷倫公司,N,N-二甲基甲酰胺測(cè)定用);AS11陰離子交換柱(4mm×250mm)及保護(hù)柱AG11(2mm×50mm)(賽默飛世爾科技公司,游離硫酸鹽測(cè)定用)。1.2降氮含量、標(biāo)準(zhǔn)溶液、苯甲醇的標(biāo)準(zhǔn)品USP依諾肝素鈉對(duì)照品(批號(hào)GOL137,Mw4421);EP依諾肝素鈉對(duì)照品(batch4);雙糖對(duì)照品ΔⅠA、ΔⅣA、ΔⅡS、ΔⅢS(Sigma公司);雙糖對(duì)照品ΔⅡA、ΔⅢA、ΔⅠS(Dextra公司);雙糖對(duì)照品ΔⅣS(SantaCruz公司);EP低分子肝素相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定用對(duì)照品(batch2,Mn=3800);WHO低分子肝素相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定用對(duì)照品(批號(hào)05/112);USP依諾肝素鈉相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定用對(duì)照品A(相對(duì)分子質(zhì)量1400、2250、5200、11000)(批號(hào)GOL138),對(duì)照品B(相對(duì)分子質(zhì)量1800、3350、7750)(批號(hào)GOL139);WHO低分子肝素第二次國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)01/608,抗FⅩa與效價(jià)每支1097u支,抗FⅡa效價(jià)每支326u);低分子量肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)140647-200801,抗FⅩa與效價(jià)每支1151u,抗FⅡa效價(jià)每支424u);亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液[中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)080223,NO2--N標(biāo)準(zhǔn)值:100mg·L-1];苯甲醇國(guó)家對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)190019-201301,99.8%);硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液[中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),GBW(E)080266,1000μg·mL-1]。1.3s-類化合物s-水質(zhì)肝素酶Ⅰ(10000U·L-1)、肝素酶Ⅱ(4000U·L-1)、肝素酶Ⅲ(5000U·L-1)(北京思清源生物科技有限公司);高氯酸鈉(Sigma公司,貨號(hào)410241,純度≥98%,1,6-脫水衍生物測(cè)定用);發(fā)色底物S-2765(N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA~2HCl,Mr714.6);發(fā)色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl,Mr625.6);抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)(10U;、Xa因子(71nkat)(意大利Chromogenix公司);凝血酶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)140625-201310,430U,牛源);醋酸鈉(Sigma公司,貨號(hào)71183,亞硝酸鹽測(cè)定用);Dowexue4d150WX8hydrogenform200~400mesh陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Sigma-Aldrich公司,貨號(hào)21751-4)。1.4批制劑及標(biāo)準(zhǔn)藥國(guó)產(chǎn)及進(jìn)口廠產(chǎn)品共11個(gè)廠家的27批原料藥,13個(gè)廠家的49批注射劑。進(jìn)口制劑為達(dá)肝素鈉注射液(法安明,輝瑞制藥有限公司);依諾肝素鈉注射液(克賽,賽諾菲安萬(wàn)特公司);那屈肝素鈣注射液[速碧林,葛蘭素史克(中國(guó))投資有限公司]。2方法和結(jié)果2.1依諾肝素鈉1.6-脫水誘導(dǎo)2.1.1分糖鏈還原端結(jié)構(gòu)的鑒定對(duì)肝素芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得依諾肝素鈉的過(guò)程中,部分糖鏈還原端會(huì)產(chǎn)生1,6-脫水衍生物結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)是依諾肝素鈉特有的,其他工藝的低分子肝素不具有這個(gè)末端結(jié)構(gòu),準(zhǔn)確測(cè)定該結(jié)構(gòu)含量,對(duì)依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)確證具有重要意義。2.1.2內(nèi)容分析體現(xiàn)了“1,6-脫水衍生物結(jié)構(gòu)”的測(cè)定2014年USP37/NF32和《歐洲藥典》8.1(EuropeanPharmacopoeia,EP)依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)的前言中都規(guī)定了“15%~25%的組分在還原端有1,6-脫水衍生物結(jié)構(gòu)”。2009年USP32/NF27第二增補(bǔ)本附錄〈207〉開(kāi)始收載1,6-脫水衍生物的測(cè)定方法,但由于USP依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)正文中沒(méi)有規(guī)定該項(xiàng)檢查,所以附錄〈207〉的方法只是指導(dǎo)性的。最新出版的EP8.1依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)中已將“1,6-脫水衍生物測(cè)定”列入鑒別項(xiàng),該標(biāo)準(zhǔn)于2014年4月執(zhí)行。我國(guó)依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)草案中已將該項(xiàng)目列入鑒別項(xiàng)。2.1.3實(shí)驗(yàn)條件的考察1,6-脫水衍生物測(cè)定方法的原理是用混合肝素酶水解依諾肝素鈉后,用高效陰離子交換色譜-紫外檢測(cè)器分析寡糖組成。參考了USP、EP和依諾肝素鈉原研廠賽諾菲安萬(wàn)特公司的企業(yè)方法,對(duì)肝素酶的選擇、酶解條件、色譜柱、流速等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了考察,實(shí)驗(yàn)方法的建立、驗(yàn)證、及檢測(cè)結(jié)果已另文報(bào)告。該項(xiàng)目是我國(guó)多糖類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中首次應(yīng)用陰離子交換色譜法對(duì)多糖酶解后生成的寡糖片段進(jìn)行定量鑒別的一個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目,對(duì)多糖類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升具有重要意義。2.2相對(duì)分子量和相對(duì)分子量的分布2.2.1lmh質(zhì)控指標(biāo)相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布是LMWH重要質(zhì)控指標(biāo)之一,它是LMWH與肝素區(qū)別的重要特征,與抗凝活性密切相關(guān),嚴(yán)格控制相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布可以保證產(chǎn)品的批間一致性。2.2.2檢查項(xiàng)的收載各國(guó)藥典及我國(guó)產(chǎn)品的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)均收載該項(xiàng)目,國(guó)外藥典只在原料藥控制,我國(guó)的3個(gè)LMWH產(chǎn)品在原料藥及制劑標(biāo)準(zhǔn)中均收載該檢查項(xiàng)。我國(guó)LMWH產(chǎn)品以前的標(biāo)準(zhǔn)限度基本上符合BP的基本要求,現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)草案中的限度基本與BP2013一致,那屈肝素鈣和依諾肝素鈉較BP2013更為嚴(yán)格(表1)。2.2.3相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照品和回收率測(cè)定比較WHO和EP的LMWH相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照品換批標(biāo)定、USP肝素相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照品國(guó)際協(xié)作標(biāo)定。充分了解各種方法,EP法最為常用,該方法使用一個(gè)特殊制備的寬分布對(duì)照品,紫外檢測(cè)器(ultravioletandvisiblewavelengthdetector,UV)和示差折光檢測(cè)器(refractiveindexdetector,RI)雙檢測(cè)器聯(lián)用,缺點(diǎn)是建立校正曲線時(shí)需要手工選點(diǎn),計(jì)算復(fù)雜,不易標(biāo)準(zhǔn)化,對(duì)小分子量片段計(jì)算不夠精確;USP依諾肝素使用7個(gè)窄分布對(duì)照品,RI單一檢測(cè)器,操作簡(jiǎn)單,測(cè)定結(jié)果也比較滿意,但窄分布對(duì)照品制備困難,價(jià)格昂貴;光散射法不需要分子量對(duì)照品,但多角激光光散射儀(mutianglelaserlightscatter,MALLS)價(jià)格昂貴,一般在分子量對(duì)照品標(biāo)定時(shí)使用,不在常規(guī)質(zhì)控中采用;WHO對(duì)照品是一個(gè)寬分布對(duì)照品,附帶寬分布標(biāo)樣表,表中給出相對(duì)分子質(zhì)量與累積峰面積百分比之間的關(guān)系,使用RI單一檢測(cè)器,該方法操作簡(jiǎn)單,對(duì)小相對(duì)分子質(zhì)量片段數(shù)據(jù)的測(cè)定結(jié)果滿意。通過(guò)比較,認(rèn)為建立類似WHO的寬分布對(duì)照品比較適合常規(guī)質(zhì)控,考慮到相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照品的同質(zhì)性,將針對(duì)3種不同工藝的產(chǎn)品分別建立寬分布相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照品,實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)準(zhǔn)確計(jì)算對(duì)照品溶液色譜圖中LMWH峰的總面積(不包括鹽峰)及每個(gè)點(diǎn)的累積峰面積百分比,確定與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照品附帶的寬分布標(biāo)樣表中累積峰面積百分比最接近點(diǎn)的保留時(shí)間及對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo),相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),使用GPC軟件,擬合三次方程,建立校正曲線,相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于0.990。相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定實(shí)驗(yàn)誤差較大,所以對(duì)3種產(chǎn)品分別設(shè)立系統(tǒng)適用性試驗(yàn)對(duì)照品,用以規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作,規(guī)定測(cè)定值應(yīng)在標(biāo)示值±3.3%之內(nèi)(達(dá)肝素鈉相對(duì)分子質(zhì)量系統(tǒng)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)對(duì)照品的重均相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)在標(biāo)示值±200內(nèi),那屈肝素鈣和依諾肝素鈉相對(duì)分子質(zhì)量系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)對(duì)照品的重均相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)在標(biāo)示值±150內(nèi)),目前我國(guó)的LMWH相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定對(duì)照品正在標(biāo)定中。2.2.4樣品測(cè)定2.3抗fa和抗fa的活性2.3.1對(duì)體內(nèi)活性的影響抗FⅩa與抗FⅡa活性是LMWH另一個(gè)重要的特性,它與體內(nèi)活性密切相關(guān)。肝素的抗FⅩa與抗FⅡa活性比值約為1,LMWH要求至少大于1.5,抗FⅩa活性用來(lái)表示LMWH的效價(jià),指導(dǎo)臨床用藥。2.3.2mwh產(chǎn)品內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)限度各國(guó)藥典及我國(guó)產(chǎn)品的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)均收載該項(xiàng)目。我國(guó)LMWH產(chǎn)品以前的標(biāo)準(zhǔn)限度基本上符合BP的基本要求,現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)草案中的限度與BP2013一致(表2),LWMH的活性與相對(duì)分子質(zhì)量是密切相關(guān)的。2.3.3方法的改進(jìn)和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)采用生色底物法,測(cè)定原理是LM-WH在過(guò)量的抗凝血酶(ATⅢ)存在下與ATⅢ形成復(fù)合物,成為凝血因子(FⅩa和FⅡa)的快速抑制劑,剩余FⅩa和FⅡa使特異性發(fā)色底物水解,生成對(duì)硝基苯胺(pNA),波長(zhǎng)405nm處測(cè)其吸收度,pNA生色的量與FⅩa和FⅡa的活性成正比,與LMWH的抗FⅩa與抗FⅡa活性成反比,這是一個(gè)微量酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)誤差較大,所以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用4×4量反應(yīng)平行線法,在實(shí)驗(yàn)時(shí),強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品在同等條件下同時(shí)實(shí)驗(yàn),標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的4個(gè)反應(yīng)濃度需呈線性且平行。BP2013和原來(lái)的LMWH國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均采用半微量生色底物法,也就是反應(yīng)在小管中進(jìn)行,反應(yīng)總體積約1mL,紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索,調(diào)整了反應(yīng)物的濃度和體積,保溫條件、反應(yīng)時(shí)間等,將半微量法改為微量法,反應(yīng)可以在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行,反應(yīng)總體積約為200μL,酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度,這樣的實(shí)驗(yàn)操作可以提高效率,節(jié)省試劑,降低檢測(cè)費(fèi)用。為了方便實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇方法,將半微量法和微量法均寫在標(biāo)準(zhǔn)中。標(biāo)準(zhǔn)草案和原來(lái)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有幾點(diǎn)不同,首先是緩沖液,擬定標(biāo)準(zhǔn)中的緩沖液采用了三羥甲基氨基甲烷(Tris)8.4緩沖液,配方中使用、聚乙二醇6000(polyethyleneglycol,PEG)作為酶的穩(wěn)定劑,原來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)使中用Tris7.4和Tris8.42種緩沖液,使用牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)做酶的穩(wěn)定劑。由于BSA是蛋白,緩沖液的保存時(shí)間不長(zhǎng),容易長(zhǎng)菌,并且配制的緩沖液有一定的黃色,影響比色,另外蛋白溶液易產(chǎn)生泡沫,影響加樣準(zhǔn)確性,所以我們選用了PEG6000做穩(wěn)定劑;第二,調(diào)整了反應(yīng)濃度,原來(lái)標(biāo)準(zhǔn)中的反應(yīng)濃度過(guò)寬,實(shí)驗(yàn)時(shí)不利用實(shí)驗(yàn)人員很快摸索適合的線性范圍,根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了調(diào)整;第三,方法改進(jìn)后,實(shí)驗(yàn)誤差可以減小,擬定標(biāo)準(zhǔn)中將可信限率由原來(lái)的不得過(guò)15%,調(diào)整至不得過(guò)10%。我院使用微量法參加了2009肝素第六次國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定和2012年LMWH第三次國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定,與BP、USP方法進(jìn)行了比較,沒(méi)有顯著性差異。2.3.4樣品測(cè)定2.4亞硝酸鹽和n-no基2.4.1面臨的n-no基合物達(dá)肝素鈉與那屈肝素鈣均使用亞硝酸降解從豬腸黏膜提取的肝素得到。肝素在提取過(guò)程中會(huì)受到蛋白和核酸的污染,在強(qiáng)亞硝化條件下會(huì)產(chǎn)生具有遺傳毒性的N-NO基加合物,亞硝酸也可能誘導(dǎo)低分子肝素糖鏈上的N-乙?；纬蒒-NO基。另外工藝中殘留的游離亞硝酸鹽,進(jìn)入體內(nèi)會(huì)引起血紅蛋白載氧功能下降,在酸性條件下與體內(nèi)仲胺反應(yīng),會(huì)生成強(qiáng)致癌性物質(zhì)N-亞硝基胺。因此對(duì)達(dá)肝素鈉與那屈肝素鈣中的亞硝酸鹽與N-NO基的控制十分必要。2.4.2n-no基檢查BP2013達(dá)肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定工藝過(guò)程應(yīng)盡量減少和去除N-NO基污染并規(guī)定了離子色譜法的亞硝酸鹽檢查,限度為5μg·g-1。BP2013那屈肝素鈣標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了N-NO基檢查,限度為0.25μg·g-1,實(shí)驗(yàn)原理為樣品在加熱回流的乙酸乙酯中被氫溴酸水解將N-NO基水解下來(lái),生成的NO氣體隨載氣經(jīng)除雜和冷卻后進(jìn)入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器,NO與檢測(cè)器中的臭氧反應(yīng)變成激發(fā)態(tài),返回基態(tài)時(shí)釋放能量,該能量轉(zhuǎn)化為電信號(hào)被檢測(cè)器記錄。我國(guó)現(xiàn)行的LMWH國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了一個(gè)顏色反應(yīng)檢查亞硝酸鹽。2.4.3線性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)偏差參考BP2013,建立了高效陰離子交換色譜與安培檢測(cè)器聯(lián)用檢測(cè)亞硝酸鹽的方法,并列入達(dá)肝素鈉和那屈肝素鈣的標(biāo)準(zhǔn)草案中,限度為5μg·g-1。該方法使用玻碳電極為工作電極的直流安培檢測(cè)模式,選擇性好,在+1.00V工作電位條件下,常見(jiàn)的干擾離子,如氯離子、硫酸根離子、硝酸根離子、磷酸根離子均不出峰(圖1);靈敏度較高,亞硝酸根檢出限為1.5ng·mL-1,定量限為5ng·mL-1;重復(fù)性較好,24ng·mL-1對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.34%(n=6);線性較好,在8~40ng·mL-1內(nèi),線性相關(guān)系數(shù)為0.9997;使用CarbopacTMPA1(4mm×50mm)色譜柱,理論板數(shù)為1553,亞硝酸峰對(duì)稱因子為0.759。也摸索了其他實(shí)驗(yàn)方法,如高效陰離子交換色譜與電導(dǎo)檢測(cè)器聯(lián)用檢測(cè),但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其他陰離子物質(zhì)干擾較大,因而還是選擇了具有高選擇性的安培檢測(cè)器實(shí)驗(yàn)。目前國(guó)內(nèi)一些LMWH企業(yè)已初步開(kāi)展對(duì)N-NO基的控制,到其中一個(gè)企業(yè)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),但該企業(yè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備與BP中規(guī)定的不完全一致,實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想,故此次標(biāo)準(zhǔn)草案中沒(méi)有規(guī)定N-NO基檢查,待實(shí)驗(yàn)方法建立后再行規(guī)定。目前在達(dá)肝素鈉、那屈肝素鈣標(biāo)準(zhǔn)草案中增加了制法要求,明確規(guī)定工藝過(guò)程應(yīng)盡量減少和去除N-NO基污染。2.4.4亞硝酸含量低對(duì)“1.4”中樣品的測(cè)試結(jié)果顯示(圖2),依諾肝素鈉中亞硝酸含量很低(小于0.2μg·g-1,達(dá)肝素鈉和那屈肝素鈣樣品亞硝酸含量較高,但只有1個(gè)廠家的樣品超過(guò)5μg·g-1度規(guī)定。2.5苯甲醇2.5.1以氨化芐基酯為原料的苯甲醇依諾肝素鈉生產(chǎn)時(shí)第一步需合成肝素芐索氯銨鹽,第二步需合成肝素芐基酯,酯化肝素時(shí)需加入氯化芐,氯化芐極易水解成苯甲醇,所以在依諾肝素鈉原料標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)控制苯甲醇含量。2.5.2內(nèi)標(biāo)法的峰面積計(jì)算BP2013和USP37依諾肝素鈉收載了苯甲醇檢查,BP2013采用內(nèi)標(biāo)法峰高計(jì)算,USP36采用外標(biāo)法峰面積計(jì)算,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,內(nèi)標(biāo)法峰面積計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度更好,因此擬定標(biāo)準(zhǔn)采用內(nèi)標(biāo)法峰面積計(jì)算,限度為“不得過(guò)0.1%”。國(guó)外有多次使用的大規(guī)格LMWH注射液,其中會(huì)加入苯甲醇作為防腐劑,含量在1%左右。USP37中依諾肝素鈉注射液中收載了該項(xiàng)檢查,由于我國(guó)的低分子肝素注射液沒(méi)有多次使用的包裝規(guī)格,所以注射液標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有收載該項(xiàng)檢查。芐索氯銨殘留可以采用比色法或高效液相色譜法進(jìn)行控制,BP2013及USP37依諾肝素鈉均未收載該項(xiàng)檢查,由于時(shí)間關(guān)系,我們未對(duì)此開(kāi)展研究,擬定標(biāo)準(zhǔn)中未收載該項(xiàng)檢查,相關(guān)研究工作后續(xù)開(kāi)展。2.5.3檢出限和測(cè)定下限反相色譜法等度分離,檢測(cè)波長(zhǎng)為256nm,內(nèi)標(biāo)物為3,4-二甲基苯酚(圖3)。供試品溶液溶于氫氧化鈉溶液中,并放置1h,使氯化芐完全轉(zhuǎn)化為苯甲醇。苯甲醇檢出限為0.2μg·mL-1,定量限為0.65μg·mL-1;重復(fù)性良好,12.5μg·mL-1對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣RSD為1.1%(n=6);線性良好,在0.65~1000μg·mL-1內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.9999;樣品加標(biāo)回收率為90.5%~103.8%(3個(gè)濃度,每個(gè)濃度重復(fù)3次)。2.5.4樣品測(cè)定對(duì)6批國(guó)內(nèi)兩個(gè)廠家的依諾肝素鈉原料藥進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果約為0.01%,均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(不得過(guò)0.1%)。2.6殘余溶劑2.6.1依諾肝素鈉溶劑殘留溶劑的控制達(dá)肝素鈉、那屈肝素鈣在生產(chǎn)工藝的后3步中,會(huì)用到乙醇,依諾肝素鈉在生產(chǎn)過(guò)程中,會(huì)用到甲醇及乙醇,根據(jù)工藝的不同,還會(huì)使用到第一類溶劑二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺,殘留溶劑的量應(yīng)該得到控制。2.6.2標(biāo)準(zhǔn)加載2.6.3毛細(xì)管柱分離檢測(cè)方法均為氣相色譜法,氫火焰離子化檢測(cè)器。甲醇、乙醇和二氯甲烷的檢測(cè)采用頂空進(jìn)樣方式,以6%氰丙苯基-94%二甲基聚硅氧烷(或極性相近)為固定液的毛細(xì)管柱進(jìn)行分離;N,N-二甲基甲酰胺的沸點(diǎn)較高,不適于使用頂空進(jìn)樣方式,而采用直接進(jìn)樣檢測(cè),以聚乙二醇(或極性相近)為固定液的毛細(xì)管柱進(jìn)行分離。2.6.4樣品測(cè)定2.7游離硫酸根2.7.1抗凝活性的研究肝素雙糖單位中有多個(gè)位置被硫酸基團(tuán)取代,硫酸基取代的位置與數(shù)量與肝素的抗凝活性密切相關(guān)。當(dāng)肝素降解為低分子肝素時(shí),糖鏈上的硫酸基團(tuán)會(huì)脫落,若生產(chǎn)工藝控制不當(dāng),硫酸基團(tuán)會(huì)過(guò)度解離,從而影響低分子肝素活性,并且低分子肝素注射液在貯藏過(guò)程中,硫酸基團(tuán)也有可能脫落。2.7.2lmwh中游離硫酸根檢查法的建立BP2013那屈肝素鈣原料和USP37依諾肝素鈉注射液中收載了游離硫酸根檢查,均采用高效陰離子交換色譜與電導(dǎo)檢測(cè)器聯(lián)用法,BP采用硼酸鹽-氫氧化鈉溶液梯度洗脫,配化學(xué)抑制器,USP采用碳酸鈉溶液等度洗脫,配陰離子自動(dòng)再生抑制器。通過(guò)實(shí)驗(yàn),我們最終參考操作更為簡(jiǎn)便的USP方法,建立了LMWH中游離硫酸根檢查法,收載在達(dá)肝素鈉、依諾肝素鈉、那屈肝素鈣原料及注射劑標(biāo)準(zhǔn)草案中。參照BP2013那屈肝素鈣中游離硫酸根的限度,將原料游離硫酸根的限度訂為“不得過(guò)質(zhì)量比0.5%”,參照USP37依諾肝素鈉注射液中游離硫酸根的限度,將注射液游離硫酸根的限度訂為“不得過(guò)質(zhì)量體積比0.12%”,此處為100mL注射液中硫酸根含量不得過(guò)0.12g,如按每1mL為10000u的注射液計(jì)算,每1mg低分子肝素效價(jià)約為100u,則換算成原料為每100g低分子肝素中硫酸根含量不得過(guò)1.2g,該限度較原料限度0.5%寬松,考慮到制成制劑后貯藏期內(nèi)磺酸基會(huì)脫落,制劑的限度需適當(dāng)放寬。2.7.3重復(fù)性與線性該方法專屬性強(qiáng),硫酸根與其他陰離子分離良好(圖4);靈敏度高,硫酸根檢出限為9ng·mL-1,定量限為30ng·mL-1;重復(fù)性良好,2μg·mL-1對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣RSD為0.5%(n=6);線性良好,在0.01~20μg·mL-1內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.9994;樣品加標(biāo)回收率為100.1%~112.4%(3個(gè)濃度,每個(gè)濃度重復(fù)3次)。需要注意的是高度硫酸化的糖胺聚糖在陰離子交換柱上有強(qiáng)吸附,會(huì)損壞色譜柱,所以應(yīng)盡量減小吸附,適當(dāng)時(shí)清洗色譜柱,可恢復(fù)部分柱效。2.7.4原料批數(shù)、劑量不符合現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)條件對(duì)“1.4”中的樣品測(cè)試結(jié)果顯示(圖5),國(guó)產(chǎn)原料不符合擬定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的批數(shù)較多,注射劑個(gè)別批次不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,原研廠樣品均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。2.8硫酸根與脂肪酸根的摩爾比2.8.1纖維素在雙糖系統(tǒng)中的降解肝素雙糖單位中含有硫酸基和羧酸基,其摩爾比值反映了肝素雙糖單位的結(jié)構(gòu)特征,一般認(rèn)為介于2~3之間,肝素降解為低分子肝素時(shí),硫酸基團(tuán)易脫落,導(dǎo)致硫酸根與羧酸根摩爾比下降。2.8.2硫酸根-羧酸根摩爾比BP2013、USP37及我國(guó)低分子肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[WS1-(X-149)-2005Z]均規(guī)定“硫酸根與羧酸根摩爾比應(yīng)不小于1.8”。此次標(biāo)準(zhǔn)草案中,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了細(xì)化和修改,增加了“樣品應(yīng)不含離子性雜質(zhì),應(yīng)用新沸放冷的去離子水實(shí)驗(yàn),冰浴,洗脫后立即滴定”等實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。2.8.3實(shí)驗(yàn)原理2.8.4層析柱的使用制備新鮮煮沸的純水2000mL,冰浴冷卻(當(dāng)天使用);0.05mol·L-1氫氧化鈉溶液50mL;1.0mol·L-1鹽酸溶液100mL;用新沸放冷的水制備的5mg·mL-1供試品溶液10mL。將樹(shù)脂用新沸冷水充分清洗、溶脹,新樹(shù)脂應(yīng)用至少2倍的水洗4~5次。在層析柱下填充一小塊蓬松脫脂棉,加水浸潤(rùn),清洗。將樹(shù)脂緩緩倒入層析柱,填充時(shí)打開(kāi)下口閥開(kāi)關(guān),避免產(chǎn)生氣泡,留一部分水在樹(shù)脂上面,樹(shù)脂應(yīng)填充得均勻、無(wú)間隙、無(wú)氣泡。層析柱用裝有碎冰的冰袋包裹。取供試品溶液2mL,沿壁緩緩加入預(yù)冷層析柱,當(dāng)樣品加入柱子后,關(guān)閉層析柱開(kāi)關(guān)2~3min,以使離子交換更加充分。然后打開(kāi)層析柱開(kāi)關(guān),以15mL水緩緩洗入50mL小燒杯中(保存在冰浴中),用洗耳球?qū)⒅袑⑺幸后w吹出。洗脫液應(yīng)立即滴定,將電導(dǎo)電極、溫度探頭、磁子放入小燒杯中,小燒杯置于冰浴中,調(diào)節(jié)磁力攪拌器,使磁子正常攪拌,待電導(dǎo)讀數(shù)穩(wěn)定后,記錄讀數(shù)。用加樣槍加入0.05mol·L-1氫氧化鈉滴定液50μL,當(dāng)電導(dǎo)讀數(shù)穩(wěn)定后,記錄并繼續(xù)滴定,直至電導(dǎo)值變化變緩,加入25μL滴定液,當(dāng)電導(dǎo)值又劇烈變化時(shí),加入50μL滴定液,直至電導(dǎo)值有規(guī)律的升高,至終點(diǎn)(電導(dǎo)值恢復(fù)到開(kāi)始滴定時(shí))。使用過(guò)的樹(shù)脂,浸泡在1mol·L-1鹽酸溶液中,過(guò)夜,用水抽濾(G4垂熔玻璃漏斗),清洗4~5次后可繼續(xù)使用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理,供試品的量、氫氧化鈉滴定液的濃度不需很準(zhǔn)確,電導(dǎo)只要在同樣條件下測(cè)定相對(duì)值即可。2.8.5垂直線垂足以電導(dǎo)為縱坐標(biāo),以滴定液的體積為橫坐標(biāo),繪制曲線。分別對(duì)突然下降,稍微爬升,急劇上升的3個(gè)線性部分圖形作出最佳直線。在第一條直線和第二條直線,第二條直線和第三條直線的交點(diǎn),分別對(duì)橫坐標(biāo)作垂直線,第一條和第二條直線交點(diǎn)的垂足是硫酸根消耗氫氧化鈉滴定液的毫升數(shù)(V1),第二條和第三條直線交點(diǎn)的垂足是硫酸根和羧酸根共同消耗氫氧化鈉滴定液(0.05mol·L-1)的毫升數(shù)(V2),V2-V1是羧酸根消耗的氫氧化鈉滴定液毫升數(shù)(圖6)。3條直線的線性回歸方程分別為Y1=a1X1+b1,Y2=a2X2+b2,Y3=a3X3+b3,當(dāng)Y1=Y2,V1=X1=X2,根據(jù)線性回歸方程得出,V1=(b2-b1)/(a1-a2),當(dāng)Y2=Y3,V2=X2=X3,根據(jù)線性回歸方程得出,V2=(b3-b2)/(a2-a3),2.8.6結(jié)果對(duì)”1.4”中的樣品測(cè)定結(jié)果顯示,國(guó)產(chǎn)及進(jìn)口低分子肝素原料的硫酸根與羧酸根摩爾比均大于1.8,符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。2.9其他2.9.1立糖苷鍵的nmr分析由于糖類結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)、核酸要復(fù)雜得多,其結(jié)構(gòu)解析成為制約糖科學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵之一。20世紀(jì)70年代,核磁共振(NMR)應(yīng)用于糖類結(jié)構(gòu)解析中后,給糖類結(jié)構(gòu)解析工作帶來(lái)了很多方便,特別是20世紀(jì)80年代2D-NMR的出現(xiàn)和發(fā)展,使得NMR成為糖類結(jié)構(gòu)解析的主要工具。NMR對(duì)表征分子結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的專屬性,1D-NMR的結(jié)果能分析得到較粗略的單糖組成、數(shù)量及雜質(zhì)信息,如需獲得更完整的結(jié)構(gòu)信息,往往需要2D-NMR。2D-NMR能確定單糖組成以及N-乙酰基、N-硫酸基和O-硫酸基的具體位置,可通過(guò)同核化學(xué)位移相關(guān)譜(COSY)、總相關(guān)譜(TOC-SY)、近程碳?xì)湎嚓P(guān)譜(HSQC)和遠(yuǎn)程碳?xì)湎嚓P(guān)(HMBC)等2D-NMR得到糖苷鍵的鏈接方式。由于肝素具有很強(qiáng)的不均一性,用NMR分析整個(gè)肝素結(jié)構(gòu)非常困難,一般情況下,需要先用肝素酶降解成二糖或寡糖片段,再進(jìn)行NMR分析。BP2013和USP37均收載了LMWH13C-NMR鑒別實(shí)驗(yàn),《中國(guó)藥典》目前還沒(méi)有采用NMR進(jìn)行實(shí)驗(yàn),此次標(biāo)準(zhǔn)草案中暫未收載NMR鑒別項(xiàng)。2.9.2依諾肝素鈉檢測(cè)nm依諾肝素鈉的非還原端結(jié)構(gòu)為4-烯醇式吡喃糖醛酸,具有α、β-不飽和酮環(huán)狀結(jié)構(gòu),在(231±2)nm的波長(zhǎng)處有最大吸收,吸收系數(shù)為14.0~20.0,擬定標(biāo)準(zhǔn)中將該項(xiàng)目作為依諾肝素鈉的鑒別項(xiàng),EP8.1和USP37均收載了該鑒別項(xiàng)。2.9.3p2p0103/p-2比色液廣東省食品藥品檢驗(yàn)所通過(guò)色差計(jì)比較了《英國(guó)藥典》和《中國(guó)藥典》顏色標(biāo)準(zhǔn)液,BP20135號(hào)比色液介于CHP20101號(hào)與2號(hào)比色液之間,標(biāo)準(zhǔn)草案中將原料的溶液顏色規(guī)定為“淺于黃色1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比色液”,制劑標(biāo)準(zhǔn)適當(dāng)放寬,規(guī)定為“淺于黃色2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比色液”,注射液的性狀項(xiàng)做相應(yīng)調(diào)整為“無(wú)色至微黃色的澄明液體”。2.9.4鈣鹽的轉(zhuǎn)化程度LMWH糖鏈的不同位點(diǎn)都修飾著帶負(fù)電荷的磺酸基團(tuán)、羧基等,肝素在提取過(guò)程中會(huì)用到氫氧化鈉溶液,成品肝素多為鈉鹽,肝素鈣則是增加了鈣鹽轉(zhuǎn)化步驟。擬定標(biāo)準(zhǔn)中采用原子吸收分光光度法測(cè)定鈉含量,因其含量較高,使用鈉的次靈敏線330.3nm處測(cè)定,溶液中加入氯化銫抑制鈉原子電離效應(yīng),不同工藝的LMWH鈉鹽限度略有不同,依諾肝素鈉的限度為“11.3%~13.5%”,達(dá)肝素鈉為“9.5%~12.5%”。那屈肝素鈣中的鈣含量測(cè)定采用絡(luò)合滴定法,限度為“9.5%~11.5%”。BP2013與USP37均收載上述檢查,限度相同。2.9.5密度檢測(cè)方法LMWH注射液裝量基本小于1mL,且很多包裝采用預(yù)裝注射器,《中國(guó)藥典》采用滴定法檢查裝量,很難找到適合的經(jīng)標(biāo)化的小容量容器,因而參考BP2013使用密度法測(cè)定裝量,密度值可采用消耗較少樣品的密度計(jì)測(cè)得。2.9.6制劑2.9.7貯藏條件及貯藏條件USP37對(duì)依諾肝素鈉的貯藏要求是20~25℃,長(zhǎng)途運(yùn)輸過(guò)程中為15~30℃,EP8.0貯藏條件為密閉、室溫(15~30℃)。LMWH原來(lái)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為“密封,在涼暗處保存(避光,不超過(guò)20℃)”。LMWH較為穩(wěn)定,因而擬定標(biāo)準(zhǔn)中將貯藏條件修改為“密封,在干燥處保存”,這樣可以減少運(yùn)輸及貯藏費(fèi)用。2.9.8檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇原來(lái)的LMWH國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)置了260、280nm波長(zhǎng)下的吸光度檢查項(xiàng),用來(lái)控制LMWH中殘留的核酸、蛋白雜質(zhì)。由于《中國(guó)藥典》2010年版肝素品種增加了這個(gè)項(xiàng)目,LMWH擬定標(biāo)準(zhǔn)將該項(xiàng)目刪除。2.9.9硼殘留EP8.0在達(dá)肝素鈉的品種下設(shè)置了硼元素的檢測(cè)項(xiàng)目。達(dá)肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中,需經(jīng)硼氫化鈉還原反應(yīng)來(lái)提高產(chǎn)品效價(jià),終產(chǎn)品會(huì)有少量硼殘留。硼是人體限量元素,若攝入過(guò)多,會(huì)引