我國低分子肝素國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂

我國低分子肝素國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂

素素是一種廣泛使用的抗凝劑，屬于高度硫酸的糖胺聚糖。2008年以來,國內(nèi)外對肝素類產(chǎn)品的質(zhì)量及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問題十分關(guān)注,歐洲和美國藥典幾次修訂了肝素鈉的藥典標(biāo)準(zhǔn),《中國藥典》2010年版也對肝素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了大幅提高。2009年和2010年連續(xù)2年的全國藥品評價性抽驗結(jié)果表明,目前我國市場上的肝素鈉注射液質(zhì)量是可靠的。低分子肝素(low-molecular-weightheparin,LM-WH)是由肝素分級或降解得到具有較低相對分子質(zhì)量的組分或片段,其抗血栓作用優(yōu)于肝素,生物利用度高、出血傾向小,是肝素的第二代產(chǎn)品。2011年LMWH注射劑評價性抽驗暴露出我國LMWH產(chǎn)品質(zhì)量及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)都存在一些問題,多批產(chǎn)品相對分子質(zhì)量與活性不合格,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與國外原研廠家的差距較大。抗凝藥市場銷售額逐年上升,國內(nèi)有多家企業(yè)同時進(jìn)行新藥申報,市場競爭激烈,對產(chǎn)品質(zhì)量要求高。LMWH已于2012年進(jìn)入我國基本藥物目錄,是《中國藥典》2015年版?zhèn)溥x品種,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高工作迫在眉睫。根據(jù)國家藥典委員會國藥典綜發(fā)210號文的要求,由中國食品藥品檢定研究院承擔(dān)LMWH的標(biāo)準(zhǔn)提高工作。首先全面梳理了LMWH國內(nèi)外產(chǎn)品及標(biāo)準(zhǔn)情況。由于生產(chǎn)工藝不同,每種LMWH的相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布、糖鏈末端結(jié)構(gòu)、糖鏈上取代基的數(shù)目和位置、抗凝活性有所不同,所以LMWH是一類產(chǎn)品,而不是一個產(chǎn)品。目前國外上市的LMWH產(chǎn)品有幾十種,我國進(jìn)口的有5種(達(dá)肝素鈉、依諾肝素鈉、那屈肝素鈣、帕肝素鈉、瑞肝素鈉)。從1998年到2014年5月,我國共批準(zhǔn)了15個廠家的15個原料生產(chǎn)文號,18個廠家的48個注射劑生產(chǎn)文號。由于LM-WH是多糖鏈混合物,結(jié)構(gòu)具有不均一性,所以LMWH屬于生物仿制藥(biosimilar)。《英國藥典》(BritishPharmacopoeia,BP)是最早收載LMWH的藥典,從1993年版的1994年增補本開始收載,BP2013年版收載了LMWH總則和5種生產(chǎn)工藝的LM-WH各論(達(dá)肝素鈉、依諾肝素鈉、那屈肝素鈣、帕肝素鈉、汀肝素鈉),總則是對LMWH產(chǎn)品的最低要求,比如重均相對分子質(zhì)量在8000以下,小于8000的級分不少于60%,抗FⅩa與抗FⅡa活性比不小于1.5等,各論中對不同工藝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量、活性、雜質(zhì)有更嚴(yán)格的要求,不同種類的LMWH應(yīng)在滿足總論要求的基礎(chǔ)上,符合各論項下的規(guī)定。除5種工藝的LMWH原料標(biāo)準(zhǔn)外,BP2013年版還收載了達(dá)肝素鈉注射液、依諾肝素鈉注射液、汀肝素鈉注射液?！稓W洲藥典》8.0版(EuropeanPharmacopoeia,EP)收載BP的原料藥標(biāo)準(zhǔn)?！睹绹幍洹?theUnitedStatesPharmacopeia,USP)從2008年第31版(USP31/NF26)第二增補本開始收載依諾肝素鈉及其注射液,最新版為2014年的第37版(USP37/NF32),《日本藥典》(JapanesePhamacopeia,JP)從2006年第15版(JPⅩⅤ)開始收載帕肝素鈉,最新版為2011年的第16版(JPⅩⅥ)。我國LMWH產(chǎn)品執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)主要是2005年新藥試行標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)正時建立的國家標(biāo)準(zhǔn)[WS1-(X-149)-2005Z等]及2005年以后審批的企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)。我國的LMWH產(chǎn)品基本達(dá)到了BP對LMWH的最低要求,但由于沒有按生產(chǎn)工藝對LMWH進(jìn)行分類管理,國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)與國外藥典和原研廠家的標(biāo)準(zhǔn)比較,在結(jié)構(gòu)表征、相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布、抗FⅩa與抗FⅡa活性、雜質(zhì)檢查等方面項目設(shè)置不全面,限度較寬。向國內(nèi)LMWH生產(chǎn)廠家及進(jìn)口原研廠家征集了樣品與資料,共收到11個廠家的27批原料藥,13個廠家的49批注射劑,未生產(chǎn)的企業(yè)提供了技術(shù)資料。根據(jù)企業(yè)申報資料,國產(chǎn)LMWH生產(chǎn)工藝主要有3種:由亞硝酸降解得到的達(dá)肝素鈉、由亞硝酸降解后選擇性去除大部分相對分子質(zhì)量小于2000的糖鏈而獲得的那屈肝素鈣、對肝素芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得的依諾肝素鈉。在原有國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,針對不同工藝LM-WH的特點,分別制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),增加對末端結(jié)構(gòu)的確證、增加工藝雜質(zhì)及降解雜質(zhì)檢查項、更嚴(yán)格的控制相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布、抗FⅩa與抗FⅡa活性比等項目限度,全面完善和修訂我國低分子肝素國家標(biāo)準(zhǔn),共擬定了8個標(biāo)準(zhǔn),包括達(dá)肝素鈉、達(dá)肝素鈉注射液、注射用達(dá)肝素鈉、那屈肝素鈉、那屈肝素鈉注射液、注射用那屈肝素鈣、依諾肝素鈉、依諾肝素鈉注射液,標(biāo)準(zhǔn)草案將在國家藥典委員會網(wǎng)站上進(jìn)行公示,筆者僅介紹標(biāo)準(zhǔn)研究工作中重要項目的起草依據(jù)及實驗結(jié)果。1儀器和試劑盒1.1fa酶標(biāo)儀測定faaLC-20AD型高效液相色譜儀,包括:SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司,1,6-脫水衍生物測定用);2695高效液相色譜儀,包括:2489紫外檢測器,2414示差折光檢測,Empower3工作站(美國Waters公司,相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布、苯甲醇測定用);DAWNHELEOS-Ⅱ十八角激光光散射儀,OptilabrEX干涉型示差檢測器(美國懷雅特公司,相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布測定用);SpectraMAX190型酶標(biāo)儀(美國MolecularDevices公司,抗FⅩa與抗FⅡa活性測定用);ICS3000離子色譜儀,包括:安培檢測器AD25(亞硝酸根測定用),電導(dǎo)檢測器(游離硫酸根測定用)(美國戴安公司);6890氣相色譜儀,包括氫火焰離子檢測器(美國Agilent公司,殘留溶劑測定用);雷磁DJS-1C型電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司,硫酸根與羧酸根摩爾比測定用);SpherisorbS5SAX(4.0mm×250mm,5μm)(美國Waters公司,1,6-脫水衍生物測定用);TSK-GELG2000SWxl凝膠色譜柱(7.5mm×30cm,5μm)(日本TOSOH公司,相對分子質(zhì)量測定用);CarboPacPA1保護(hù)柱(4mm×50mm)(賽默飛世爾科技公司,亞硝酸鹽測定用);HIBARC8柱(4.6mm×15mm,5μm)(默克公司,苯甲醇測定用);DB624毛細(xì)管柱(0.53mm×30m,3μm)(安捷倫公司,甲醇、乙醇、二氯甲烷測定用);INNOWaxPolyethyleneGlycol毛細(xì)管色譜柱(0.53mm×30m,1μm)(安捷倫公司,N,N-二甲基甲酰胺測定用);AS11陰離子交換柱(4mm×250mm)及保護(hù)柱AG11(2mm×50mm)(賽默飛世爾科技公司,游離硫酸鹽測定用)。1.2降氮含量、標(biāo)準(zhǔn)溶液、苯甲醇的標(biāo)準(zhǔn)品USP依諾肝素鈉對照品(批號GOL137,Mw4421);EP依諾肝素鈉對照品(batch4);雙糖對照品ΔⅠA、ΔⅣA、ΔⅡS、ΔⅢS(Sigma公司);雙糖對照品ΔⅡA、ΔⅢA、ΔⅠS(Dextra公司);雙糖對照品ΔⅣS(SantaCruz公司);EP低分子肝素相對分子質(zhì)量測定用對照品(batch2,Mn=3800);WHO低分子肝素相對分子質(zhì)量測定用對照品(批號05/112);USP依諾肝素鈉相對分子質(zhì)量測定用對照品A(相對分子質(zhì)量1400、2250、5200、11000)(批號GOL138),對照品B(相對分子質(zhì)量1800、3350、7750)(批號GOL139);WHO低分子肝素第二次國際標(biāo)準(zhǔn)品(批號01/608,抗FⅩa與效價每支1097u支,抗FⅡa效價每支326u);低分子量肝素國家標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院,批號140647-200801,抗FⅩa與效價每支1151u,抗FⅡa效價每支424u);亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液[中國計量科學(xué)研究院,國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)080223,NO2--N標(biāo)準(zhǔn)值:100mg·L-1];苯甲醇國家對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號190019-201301,99.8%);硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液[中國計量科學(xué)研究院,國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),GBW(E)080266,1000μg·mL-1]。1.3s-類化合物s-水質(zhì)肝素酶Ⅰ(10000U·L-1)、肝素酶Ⅱ(4000U·L-1)、肝素酶Ⅲ(5000U·L-1)(北京思清源生物科技有限公司);高氯酸鈉(Sigma公司,貨號410241,純度≥98%,1,6-脫水衍生物測定用);發(fā)色底物S-2765(N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA~2HCl,Mr714.6);發(fā)色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl,Mr625.6);抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)(10U;、Xa因子(71nkat)(意大利Chromogenix公司);凝血酶國家標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院,批號140625-201310,430U,牛源);醋酸鈉(Sigma公司,貨號71183,亞硝酸鹽測定用);Dowexue4d150WX8hydrogenform200~400mesh陽離子交換樹脂(Sigma-Aldrich公司,貨號21751-4)。1.4批制劑及標(biāo)準(zhǔn)藥國產(chǎn)及進(jìn)口廠產(chǎn)品共11個廠家的27批原料藥,13個廠家的49批注射劑。進(jìn)口制劑為達(dá)肝素鈉注射液(法安明,輝瑞制藥有限公司);依諾肝素鈉注射液(克賽,賽諾菲安萬特公司);那屈肝素鈣注射液[速碧林,葛蘭素史克(中國)投資有限公司]。2方法和結(jié)果2.1依諾肝素鈉1.6-脫水誘導(dǎo)2.1.1分糖鏈還原端結(jié)構(gòu)的鑒定對肝素芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得依諾肝素鈉的過程中,部分糖鏈還原端會產(chǎn)生1,6-脫水衍生物結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)是依諾肝素鈉特有的,其他工藝的低分子肝素不具有這個末端結(jié)構(gòu),準(zhǔn)確測定該結(jié)構(gòu)含量,對依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)確證具有重要意義。2.1.2內(nèi)容分析體現(xiàn)了“1,6-脫水衍生物結(jié)構(gòu)”的測定2014年USP37/NF32和《歐洲藥典》8.1(EuropeanPharmacopoeia,EP)依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)的前言中都規(guī)定了“15%~25%的組分在還原端有1,6-脫水衍生物結(jié)構(gòu)”。2009年USP32/NF27第二增補本附錄〈207〉開始收載1,6-脫水衍生物的測定方法,但由于USP依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)正文中沒有規(guī)定該項檢查,所以附錄〈207〉的方法只是指導(dǎo)性的。最新出版的EP8.1依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)中已將“1,6-脫水衍生物測定”列入鑒別項,該標(biāo)準(zhǔn)于2014年4月執(zhí)行。我國依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)草案中已將該項目列入鑒別項。2.1.3實驗條件的考察1,6-脫水衍生物測定方法的原理是用混合肝素酶水解依諾肝素鈉后,用高效陰離子交換色譜-紫外檢測器分析寡糖組成。參考了USP、EP和依諾肝素鈉原研廠賽諾菲安萬特公司的企業(yè)方法,對肝素酶的選擇、酶解條件、色譜柱、流速等實驗條件進(jìn)行了考察,實驗方法的建立、驗證、及檢測結(jié)果已另文報告。該項目是我國多糖類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中首次應(yīng)用陰離子交換色譜法對多糖酶解后生成的寡糖片段進(jìn)行定量鑒別的一個檢驗項目,對多糖類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升具有重要意義。2.2相對分子量和相對分子量的分布2.2.1lmh質(zhì)控指標(biāo)相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布是LMWH重要質(zhì)控指標(biāo)之一,它是LMWH與肝素區(qū)別的重要特征,與抗凝活性密切相關(guān),嚴(yán)格控制相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布可以保證產(chǎn)品的批間一致性。2.2.2檢查項的收載各國藥典及我國產(chǎn)品的注冊標(biāo)準(zhǔn)均收載該項目,國外藥典只在原料藥控制,我國的3個LMWH產(chǎn)品在原料藥及制劑標(biāo)準(zhǔn)中均收載該檢查項。我國LMWH產(chǎn)品以前的標(biāo)準(zhǔn)限度基本上符合BP的基本要求,現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)草案中的限度基本與BP2013一致,那屈肝素鈣和依諾肝素鈉較BP2013更為嚴(yán)格(表1)。2.2.3相對分子質(zhì)量對照品和回收率測定比較WHO和EP的LMWH相對分子質(zhì)量對照品換批標(biāo)定、USP肝素相對分子質(zhì)量對照品國際協(xié)作標(biāo)定。充分了解各種方法,EP法最為常用,該方法使用一個特殊制備的寬分布對照品,紫外檢測器(ultravioletandvisiblewavelengthdetector,UV)和示差折光檢測器(refractiveindexdetector,RI)雙檢測器聯(lián)用,缺點是建立校正曲線時需要手工選點,計算復(fù)雜,不易標(biāo)準(zhǔn)化,對小分子量片段計算不夠精確;USP依諾肝素使用7個窄分布對照品,RI單一檢測器,操作簡單,測定結(jié)果也比較滿意,但窄分布對照品制備困難,價格昂貴;光散射法不需要分子量對照品,但多角激光光散射儀(mutianglelaserlightscatter,MALLS)價格昂貴,一般在分子量對照品標(biāo)定時使用,不在常規(guī)質(zhì)控中采用;WHO對照品是一個寬分布對照品,附帶寬分布標(biāo)樣表,表中給出相對分子質(zhì)量與累積峰面積百分比之間的關(guān)系,使用RI單一檢測器,該方法操作簡單,對小相對分子質(zhì)量片段數(shù)據(jù)的測定結(jié)果滿意。通過比較,認(rèn)為建立類似WHO的寬分布對照品比較適合常規(guī)質(zhì)控,考慮到相對分子質(zhì)量對照品的同質(zhì)性,將針對3種不同工藝的產(chǎn)品分別建立寬分布相對分子質(zhì)量對照品,實驗時應(yīng)準(zhǔn)確計算對照品溶液色譜圖中LMWH峰的總面積(不包括鹽峰)及每個點的累積峰面積百分比,確定與相對分子質(zhì)量對照品附帶的寬分布標(biāo)樣表中累積峰面積百分比最接近點的保留時間及對應(yīng)的相對分子質(zhì)量。以保留時間為橫坐標(biāo),相對分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標(biāo),使用GPC軟件,擬合三次方程,建立校正曲線,相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于0.990。相對分子質(zhì)量測定實驗誤差較大,所以對3種產(chǎn)品分別設(shè)立系統(tǒng)適用性試驗對照品,用以規(guī)范實驗操作,規(guī)定測定值應(yīng)在標(biāo)示值±3.3%之內(nèi)(達(dá)肝素鈉相對分子質(zhì)量系統(tǒng)系統(tǒng)適用性試驗對照品的重均相對分子質(zhì)量應(yīng)在標(biāo)示值±200內(nèi),那屈肝素鈣和依諾肝素鈉相對分子質(zhì)量系統(tǒng)適用性實驗對照品的重均相對分子質(zhì)量應(yīng)在標(biāo)示值±150內(nèi)),目前我國的LMWH相對分子質(zhì)量測定對照品正在標(biāo)定中。2.2.4樣品測定2.3抗fa和抗fa的活性2.3.1對體內(nèi)活性的影響抗FⅩa與抗FⅡa活性是LMWH另一個重要的特性,它與體內(nèi)活性密切相關(guān)。肝素的抗FⅩa與抗FⅡa活性比值約為1,LMWH要求至少大于1.5,抗FⅩa活性用來表示LMWH的效價,指導(dǎo)臨床用藥。2.3.2mwh產(chǎn)品內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)限度各國藥典及我國產(chǎn)品的注冊標(biāo)準(zhǔn)均收載該項目。我國LMWH產(chǎn)品以前的標(biāo)準(zhǔn)限度基本上符合BP的基本要求,現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)草案中的限度與BP2013一致(表2),LWMH的活性與相對分子質(zhì)量是密切相關(guān)的。2.3.3方法的改進(jìn)和改進(jìn)實驗采用生色底物法,測定原理是LM-WH在過量的抗凝血酶(ATⅢ)存在下與ATⅢ形成復(fù)合物,成為凝血因子(FⅩa和FⅡa)的快速抑制劑,剩余FⅩa和FⅡa使特異性發(fā)色底物水解,生成對硝基苯胺(pNA),波長405nm處測其吸收度,pNA生色的量與FⅩa和FⅡa的活性成正比,與LMWH的抗FⅩa與抗FⅡa活性成反比,這是一個微量酶反應(yīng)實驗,實驗誤差較大,所以實驗設(shè)計采用4×4量反應(yīng)平行線法,在實驗時,強調(diào)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品在同等條件下同時實驗,標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的4個反應(yīng)濃度需呈線性且平行。BP2013和原來的LMWH國家標(biāo)準(zhǔn)均采用半微量生色底物法,也就是反應(yīng)在小管中進(jìn)行,反應(yīng)總體積約1mL,紫外分光光度計測定吸光度。通過實驗摸索,調(diào)整了反應(yīng)物的濃度和體積,保溫條件、反應(yīng)時間等,將半微量法改為微量法,反應(yīng)可以在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行,反應(yīng)總體積約為200μL,酶標(biāo)儀測定吸光度,這樣的實驗操作可以提高效率,節(jié)省試劑,降低檢測費用。為了方便實驗人員根據(jù)實驗條件選擇方法,將半微量法和微量法均寫在標(biāo)準(zhǔn)中。標(biāo)準(zhǔn)草案和原來的國家標(biāo)準(zhǔn)有幾點不同,首先是緩沖液,擬定標(biāo)準(zhǔn)中的緩沖液采用了三羥甲基氨基甲烷(Tris)8.4緩沖液,配方中使用、聚乙二醇6000(polyethyleneglycol,PEG)作為酶的穩(wěn)定劑,原來的標(biāo)準(zhǔn)使中用Tris7.4和Tris8.42種緩沖液,使用牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)做酶的穩(wěn)定劑。由于BSA是蛋白,緩沖液的保存時間不長,容易長菌,并且配制的緩沖液有一定的黃色,影響比色,另外蛋白溶液易產(chǎn)生泡沫,影響加樣準(zhǔn)確性,所以我們選用了PEG6000做穩(wěn)定劑;第二,調(diào)整了反應(yīng)濃度,原來標(biāo)準(zhǔn)中的反應(yīng)濃度過寬,實驗時不利用實驗人員很快摸索適合的線性范圍,根據(jù)自己的實驗經(jīng)驗進(jìn)行了調(diào)整;第三,方法改進(jìn)后,實驗誤差可以減小,擬定標(biāo)準(zhǔn)中將可信限率由原來的不得過15%,調(diào)整至不得過10%。我院使用微量法參加了2009肝素第六次國際標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定和2012年LMWH第三次國際標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定,與BP、USP方法進(jìn)行了比較,沒有顯著性差異。2.3.4樣品測定2.4亞硝酸鹽和n-no基2.4.1面臨的n-no基合物達(dá)肝素鈉與那屈肝素鈣均使用亞硝酸降解從豬腸黏膜提取的肝素得到。肝素在提取過程中會受到蛋白和核酸的污染,在強亞硝化條件下會產(chǎn)生具有遺傳毒性的N-NO基加合物,亞硝酸也可能誘導(dǎo)低分子肝素糖鏈上的N-乙?；纬蒒-NO基。另外工藝中殘留的游離亞硝酸鹽,進(jìn)入體內(nèi)會引起血紅蛋白載氧功能下降,在酸性條件下與體內(nèi)仲胺反應(yīng),會生成強致癌性物質(zhì)N-亞硝基胺。因此對達(dá)肝素鈉與那屈肝素鈣中的亞硝酸鹽與N-NO基的控制十分必要。2.4.2n-no基檢查BP2013達(dá)肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定工藝過程應(yīng)盡量減少和去除N-NO基污染并規(guī)定了離子色譜法的亞硝酸鹽檢查,限度為5μg·g-1。BP2013那屈肝素鈣標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了N-NO基檢查,限度為0.25μg·g-1,實驗原理為樣品在加熱回流的乙酸乙酯中被氫溴酸水解將N-NO基水解下來,生成的NO氣體隨載氣經(jīng)除雜和冷卻后進(jìn)入化學(xué)發(fā)光檢測器,NO與檢測器中的臭氧反應(yīng)變成激發(fā)態(tài),返回基態(tài)時釋放能量,該能量轉(zhuǎn)化為電信號被檢測器記錄。我國現(xiàn)行的LMWH國家標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了一個顏色反應(yīng)檢查亞硝酸鹽。2.4.3線性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)偏差參考BP2013,建立了高效陰離子交換色譜與安培檢測器聯(lián)用檢測亞硝酸鹽的方法,并列入達(dá)肝素鈉和那屈肝素鈣的標(biāo)準(zhǔn)草案中,限度為5μg·g-1。該方法使用玻碳電極為工作電極的直流安培檢測模式,選擇性好,在+1.00V工作電位條件下,常見的干擾離子,如氯離子、硫酸根離子、硝酸根離子、磷酸根離子均不出峰(圖1);靈敏度較高,亞硝酸根檢出限為1.5ng·mL-1,定量限為5ng·mL-1;重復(fù)性較好,24ng·mL-1對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.34%(n=6);線性較好,在8~40ng·mL-1內(nèi),線性相關(guān)系數(shù)為0.9997;使用CarbopacTMPA1(4mm×50mm)色譜柱,理論板數(shù)為1553,亞硝酸峰對稱因子為0.759。也摸索了其他實驗方法,如高效陰離子交換色譜與電導(dǎo)檢測器聯(lián)用檢測,但實驗中發(fā)現(xiàn)其他陰離子物質(zhì)干擾較大,因而還是選擇了具有高選擇性的安培檢測器實驗。目前國內(nèi)一些LMWH企業(yè)已初步開展對N-NO基的控制,到其中一個企業(yè)進(jìn)行了實驗,但該企業(yè)實驗設(shè)備與BP中規(guī)定的不完全一致,實驗結(jié)果不理想,故此次標(biāo)準(zhǔn)草案中沒有規(guī)定N-NO基檢查,待實驗方法建立后再行規(guī)定。目前在達(dá)肝素鈉、那屈肝素鈣標(biāo)準(zhǔn)草案中增加了制法要求,明確規(guī)定工藝過程應(yīng)盡量減少和去除N-NO基污染。2.4.4亞硝酸含量低對“1.4”中樣品的測試結(jié)果顯示(圖2),依諾肝素鈉中亞硝酸含量很低(小于0.2μg·g-1,達(dá)肝素鈉和那屈肝素鈣樣品亞硝酸含量較高,但只有1個廠家的樣品超過5μg·g-1度規(guī)定。2.5苯甲醇2.5.1以氨化芐基酯為原料的苯甲醇依諾肝素鈉生產(chǎn)時第一步需合成肝素芐索氯銨鹽,第二步需合成肝素芐基酯,酯化肝素時需加入氯化芐,氯化芐極易水解成苯甲醇,所以在依諾肝素鈉原料標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)控制苯甲醇含量。2.5.2內(nèi)標(biāo)法的峰面積計算BP2013和USP37依諾肝素鈉收載了苯甲醇檢查,BP2013采用內(nèi)標(biāo)法峰高計算,USP36采用外標(biāo)法峰面積計算,根據(jù)實驗結(jié)果,內(nèi)標(biāo)法峰面積計算結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度更好,因此擬定標(biāo)準(zhǔn)采用內(nèi)標(biāo)法峰面積計算,限度為“不得過0.1%”。國外有多次使用的大規(guī)格LMWH注射液,其中會加入苯甲醇作為防腐劑,含量在1%左右。USP37中依諾肝素鈉注射液中收載了該項檢查,由于我國的低分子肝素注射液沒有多次使用的包裝規(guī)格,所以注射液標(biāo)準(zhǔn)中沒有收載該項檢查。芐索氯銨殘留可以采用比色法或高效液相色譜法進(jìn)行控制,BP2013及USP37依諾肝素鈉均未收載該項檢查,由于時間關(guān)系,我們未對此開展研究,擬定標(biāo)準(zhǔn)中未收載該項檢查,相關(guān)研究工作后續(xù)開展。2.5.3檢出限和測定下限反相色譜法等度分離,檢測波長為256nm,內(nèi)標(biāo)物為3,4-二甲基苯酚(圖3)。供試品溶液溶于氫氧化鈉溶液中,并放置1h,使氯化芐完全轉(zhuǎn)化為苯甲醇。苯甲醇檢出限為0.2μg·mL-1,定量限為0.65μg·mL-1;重復(fù)性良好,12.5μg·mL-1對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣RSD為1.1%(n=6);線性良好,在0.65~1000μg·mL-1內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.9999;樣品加標(biāo)回收率為90.5%~103.8%(3個濃度,每個濃度重復(fù)3次)。2.5.4樣品測定對6批國內(nèi)兩個廠家的依諾肝素鈉原料藥進(jìn)行測定,結(jié)果約為0.01%,均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(不得過0.1%)。2.6殘余溶劑2.6.1依諾肝素鈉溶劑殘留溶劑的控制達(dá)肝素鈉、那屈肝素鈣在生產(chǎn)工藝的后3步中,會用到乙醇,依諾肝素鈉在生產(chǎn)過程中,會用到甲醇及乙醇,根據(jù)工藝的不同,還會使用到第一類溶劑二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺,殘留溶劑的量應(yīng)該得到控制。2.6.2標(biāo)準(zhǔn)加載2.6.3毛細(xì)管柱分離檢測方法均為氣相色譜法,氫火焰離子化檢測器。甲醇、乙醇和二氯甲烷的檢測采用頂空進(jìn)樣方式,以6%氰丙苯基-94%二甲基聚硅氧烷(或極性相近)為固定液的毛細(xì)管柱進(jìn)行分離;N,N-二甲基甲酰胺的沸點較高,不適于使用頂空進(jìn)樣方式,而采用直接進(jìn)樣檢測,以聚乙二醇(或極性相近)為固定液的毛細(xì)管柱進(jìn)行分離。2.6.4樣品測定2.7游離硫酸根2.7.1抗凝活性的研究肝素雙糖單位中有多個位置被硫酸基團取代,硫酸基取代的位置與數(shù)量與肝素的抗凝活性密切相關(guān)。當(dāng)肝素降解為低分子肝素時,糖鏈上的硫酸基團會脫落,若生產(chǎn)工藝控制不當(dāng),硫酸基團會過度解離,從而影響低分子肝素活性,并且低分子肝素注射液在貯藏過程中,硫酸基團也有可能脫落。2.7.2lmwh中游離硫酸根檢查法的建立BP2013那屈肝素鈣原料和USP37依諾肝素鈉注射液中收載了游離硫酸根檢查,均采用高效陰離子交換色譜與電導(dǎo)檢測器聯(lián)用法,BP采用硼酸鹽-氫氧化鈉溶液梯度洗脫,配化學(xué)抑制器,USP采用碳酸鈉溶液等度洗脫,配陰離子自動再生抑制器。通過實驗,我們最終參考操作更為簡便的USP方法,建立了LMWH中游離硫酸根檢查法,收載在達(dá)肝素鈉、依諾肝素鈉、那屈肝素鈣原料及注射劑標(biāo)準(zhǔn)草案中。參照BP2013那屈肝素鈣中游離硫酸根的限度,將原料游離硫酸根的限度訂為“不得過質(zhì)量比0.5%”,參照USP37依諾肝素鈉注射液中游離硫酸根的限度,將注射液游離硫酸根的限度訂為“不得過質(zhì)量體積比0.12%”,此處為100mL注射液中硫酸根含量不得過0.12g,如按每1mL為10000u的注射液計算,每1mg低分子肝素效價約為100u,則換算成原料為每100g低分子肝素中硫酸根含量不得過1.2g,該限度較原料限度0.5%寬松,考慮到制成制劑后貯藏期內(nèi)磺酸基會脫落,制劑的限度需適當(dāng)放寬。2.7.3重復(fù)性與線性該方法專屬性強,硫酸根與其他陰離子分離良好(圖4);靈敏度高,硫酸根檢出限為9ng·mL-1,定量限為30ng·mL-1;重復(fù)性良好,2μg·mL-1對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣RSD為0.5%(n=6);線性良好,在0.01~20μg·mL-1內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.9994;樣品加標(biāo)回收率為100.1%~112.4%(3個濃度,每個濃度重復(fù)3次)。需要注意的是高度硫酸化的糖胺聚糖在陰離子交換柱上有強吸附,會損壞色譜柱,所以應(yīng)盡量減小吸附,適當(dāng)時清洗色譜柱,可恢復(fù)部分柱效。2.7.4原料批數(shù)、劑量不符合現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)條件對“1.4”中的樣品測試結(jié)果顯示(圖5),國產(chǎn)原料不符合擬定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的批數(shù)較多,注射劑個別批次不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,原研廠樣品均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。2.8硫酸根與脂肪酸根的摩爾比2.8.1纖維素在雙糖系統(tǒng)中的降解肝素雙糖單位中含有硫酸基和羧酸基,其摩爾比值反映了肝素雙糖單位的結(jié)構(gòu)特征,一般認(rèn)為介于2~3之間,肝素降解為低分子肝素時,硫酸基團易脫落,導(dǎo)致硫酸根與羧酸根摩爾比下降。2.8.2硫酸根-羧酸根摩爾比BP2013、USP37及我國低分子肝素鈉國家標(biāo)準(zhǔn)[WS1-(X-149)-2005Z]均規(guī)定“硫酸根與羧酸根摩爾比應(yīng)不小于1.8”。此次標(biāo)準(zhǔn)草案中,對實驗條件進(jìn)行了細(xì)化和修改,增加了“樣品應(yīng)不含離子性雜質(zhì),應(yīng)用新沸放冷的去離子水實驗,冰浴,洗脫后立即滴定”等實驗注意事項。2.8.3實驗原理2.8.4層析柱的使用制備新鮮煮沸的純水2000mL,冰浴冷卻(當(dāng)天使用);0.05mol·L-1氫氧化鈉溶液50mL;1.0mol·L-1鹽酸溶液100mL;用新沸放冷的水制備的5mg·mL-1供試品溶液10mL。將樹脂用新沸冷水充分清洗、溶脹,新樹脂應(yīng)用至少2倍的水洗4~5次。在層析柱下填充一小塊蓬松脫脂棉,加水浸潤,清洗。將樹脂緩緩倒入層析柱,填充時打開下口閥開關(guān),避免產(chǎn)生氣泡,留一部分水在樹脂上面,樹脂應(yīng)填充得均勻、無間隙、無氣泡。層析柱用裝有碎冰的冰袋包裹。取供試品溶液2mL,沿壁緩緩加入預(yù)冷層析柱,當(dāng)樣品加入柱子后,關(guān)閉層析柱開關(guān)2~3min,以使離子交換更加充分。然后打開層析柱開關(guān),以15mL水緩緩洗入50mL小燒杯中(保存在冰浴中),用洗耳球?qū)⒅袑⑺幸后w吹出。洗脫液應(yīng)立即滴定,將電導(dǎo)電極、溫度探頭、磁子放入小燒杯中,小燒杯置于冰浴中,調(diào)節(jié)磁力攪拌器,使磁子正常攪拌,待電導(dǎo)讀數(shù)穩(wěn)定后,記錄讀數(shù)。用加樣槍加入0.05mol·L-1氫氧化鈉滴定液50μL,當(dāng)電導(dǎo)讀數(shù)穩(wěn)定后,記錄并繼續(xù)滴定,直至電導(dǎo)值變化變緩,加入25μL滴定液,當(dāng)電導(dǎo)值又劇烈變化時,加入50μL滴定液,直至電導(dǎo)值有規(guī)律的升高,至終點(電導(dǎo)值恢復(fù)到開始滴定時)。使用過的樹脂,浸泡在1mol·L-1鹽酸溶液中,過夜,用水抽濾(G4垂熔玻璃漏斗),清洗4~5次后可繼續(xù)使用。根據(jù)實驗原理,供試品的量、氫氧化鈉滴定液的濃度不需很準(zhǔn)確,電導(dǎo)只要在同樣條件下測定相對值即可。2.8.5垂直線垂足以電導(dǎo)為縱坐標(biāo),以滴定液的體積為橫坐標(biāo),繪制曲線。分別對突然下降,稍微爬升,急劇上升的3個線性部分圖形作出最佳直線。在第一條直線和第二條直線,第二條直線和第三條直線的交點,分別對橫坐標(biāo)作垂直線,第一條和第二條直線交點的垂足是硫酸根消耗氫氧化鈉滴定液的毫升數(shù)(V1),第二條和第三條直線交點的垂足是硫酸根和羧酸根共同消耗氫氧化鈉滴定液(0.05mol·L-1)的毫升數(shù)(V2),V2-V1是羧酸根消耗的氫氧化鈉滴定液毫升數(shù)(圖6)。3條直線的線性回歸方程分別為Y1=a1X1+b1,Y2=a2X2+b2,Y3=a3X3+b3,當(dāng)Y1=Y2,V1=X1=X2,根據(jù)線性回歸方程得出,V1=(b2-b1)/(a1-a2),當(dāng)Y2=Y3,V2=X2=X3,根據(jù)線性回歸方程得出,V2=(b3-b2)/(a2-a3),2.8.6結(jié)果對”1.4”中的樣品測定結(jié)果顯示,國產(chǎn)及進(jìn)口低分子肝素原料的硫酸根與羧酸根摩爾比均大于1.8,符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。2.9其他2.9.1立糖苷鍵的nmr分析由于糖類結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)、核酸要復(fù)雜得多,其結(jié)構(gòu)解析成為制約糖科學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵之一。20世紀(jì)70年代,核磁共振(NMR)應(yīng)用于糖類結(jié)構(gòu)解析中后,給糖類結(jié)構(gòu)解析工作帶來了很多方便,特別是20世紀(jì)80年代2D-NMR的出現(xiàn)和發(fā)展,使得NMR成為糖類結(jié)構(gòu)解析的主要工具。NMR對表征分子結(jié)構(gòu)具有很強的專屬性,1D-NMR的結(jié)果能分析得到較粗略的單糖組成、數(shù)量及雜質(zhì)信息,如需獲得更完整的結(jié)構(gòu)信息,往往需要2D-NMR。2D-NMR能確定單糖組成以及N-乙?；-硫酸基和O-硫酸基的具體位置,可通過同核化學(xué)位移相關(guān)譜(COSY)、總相關(guān)譜(TOC-SY)、近程碳?xì)湎嚓P(guān)譜(HSQC)和遠(yuǎn)程碳?xì)湎嚓P(guān)(HMBC)等2D-NMR得到糖苷鍵的鏈接方式。由于肝素具有很強的不均一性,用NMR分析整個肝素結(jié)構(gòu)非常困難,一般情況下,需要先用肝素酶降解成二糖或寡糖片段,再進(jìn)行NMR分析。BP2013和USP37均收載了LMWH13C-NMR鑒別實驗,《中國藥典》目前還沒有采用NMR進(jìn)行實驗,此次標(biāo)準(zhǔn)草案中暫未收載NMR鑒別項。2.9.2依諾肝素鈉檢測nm依諾肝素鈉的非還原端結(jié)構(gòu)為4-烯醇式吡喃糖醛酸,具有α、β-不飽和酮環(huán)狀結(jié)構(gòu),在(231±2)nm的波長處有最大吸收,吸收系數(shù)為14.0~20.0,擬定標(biāo)準(zhǔn)中將該項目作為依諾肝素鈉的鑒別項,EP8.1和USP37均收載了該鑒別項。2.9.3p2p0103/p-2比色液廣東省食品藥品檢驗所通過色差計比較了《英國藥典》和《中國藥典》顏色標(biāo)準(zhǔn)液,BP20135號比色液介于CHP20101號與2號比色液之間,標(biāo)準(zhǔn)草案中將原料的溶液顏色規(guī)定為“淺于黃色1號標(biāo)準(zhǔn)比色液”,制劑標(biāo)準(zhǔn)適當(dāng)放寬,規(guī)定為“淺于黃色2號標(biāo)準(zhǔn)比色液”,注射液的性狀項做相應(yīng)調(diào)整為“無色至微黃色的澄明液體”。2.9.4鈣鹽的轉(zhuǎn)化程度LMWH糖鏈的不同位點都修飾著帶負(fù)電荷的磺酸基團、羧基等,肝素在提取過程中會用到氫氧化鈉溶液,成品肝素多為鈉鹽,肝素鈣則是增加了鈣鹽轉(zhuǎn)化步驟。擬定標(biāo)準(zhǔn)中采用原子吸收分光光度法測定鈉含量,因其含量較高,使用鈉的次靈敏線330.3nm處測定,溶液中加入氯化銫抑制鈉原子電離效應(yīng),不同工藝的LMWH鈉鹽限度略有不同,依諾肝素鈉的限度為“11.3%~13.5%”,達(dá)肝素鈉為“9.5%~12.5%”。那屈肝素鈣中的鈣含量測定采用絡(luò)合滴定法,限度為“9.5%~11.5%”。BP2013與USP37均收載上述檢查,限度相同。2.9.5密度檢測方法LMWH注射液裝量基本小于1mL,且很多包裝采用預(yù)裝注射器,《中國藥典》采用滴定法檢查裝量,很難找到適合的經(jīng)標(biāo)化的小容量容器,因而參考BP2013使用密度法測定裝量,密度值可采用消耗較少樣品的密度計測得。2.9.6制劑2.9.7貯藏條件及貯藏條件USP37對依諾肝素鈉的貯藏要求是20~25℃,長途運輸過程中為15~30℃,EP8.0貯藏條件為密閉、室溫(15~30℃)。LMWH原來的國家標(biāo)準(zhǔn)為“密封,在涼暗處保存(避光,不超過20℃)”。LMWH較為穩(wěn)定,因而擬定標(biāo)準(zhǔn)中將貯藏條件修改為“密封,在干燥處保存”,這樣可以減少運輸及貯藏費用。2.9.8檢測波長的選擇原來的LMWH國家標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)置了260、280nm波長下的吸光度檢查項,用來控制LMWH中殘留的核酸、蛋白雜質(zhì)。由于《中國藥典》2010年版肝素品種增加了這個項目,LMWH擬定標(biāo)準(zhǔn)將該項目刪除。2.9.9硼殘留EP8.0在達(dá)肝素鈉的品種下設(shè)置了硼元素的檢測項目。達(dá)肝素鈉生產(chǎn)過程中,需經(jīng)硼氫化鈉還原反應(yīng)來提高產(chǎn)品效價,終產(chǎn)品會有少量硼殘留。硼是人體限量元素,若攝入過多,會引