基因工程與基因組學(xué)-2

第11章基因工程和基因組學(xué)第一節(jié)基因工程基因工程概念：廣義：包括細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程等狹義：基因工程一、基因工程概述20世紀(jì)70年代初，DNA重組技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生1971,美國Smith,H.O.

細(xì)菌限制性酶，酶切病毒DNA分子——DNA重組時(shí)代的開始1972,Berg,P.

猿猴病毒DNA

λ噬菌體

DNA1973，Cohen,S

酶切后的外源DNA分子+質(zhì)粒誕生：分離限制性酶新的DNA分子重組DNA分子1982，美國食品既藥物管理局批準(zhǔn)，首例基因工程產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)——細(xì)菌中表達(dá)人胰島素1985，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功1996，克隆羊誕生基因工程——改造，創(chuàng)建生命形態(tài)；生產(chǎn)藥品、疫苗、牛奶和食品；診斷和治療遺傳疾??；成為當(dāng)今人類社會(huì)日常生活的組成部分。應(yīng)用：DNA重組——?jiǎng)?chuàng)造自然界沒有的DNA分子新組合

分子生物學(xué)、核酸化學(xué)、微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段——綜合技術(shù)包括：1.從細(xì)胞和組織中分離DNA2.識(shí)別特異DNA序列的限制性內(nèi)切核酸酶酶切DNA分子，制備DNA3.DNA片斷+載體重組DNA分子4.重組DNA分子宿主細(xì)胞產(chǎn)生多個(gè)相同的拷貝，克隆clone5.重組DNA分子通過細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中6.從宿主細(xì)胞中回收、純化、分析克隆的重組DNA分子7.克隆的DNA能轉(zhuǎn)錄成mRNA、翻譯蛋白質(zhì)。能分離、鑒定基因產(chǎn)物宿主細(xì)胞中自我復(fù)制二、限制性內(nèi)切核酸酶基因工程的工具、基石功能：識(shí)別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，切斷雙鏈的DNA。降解細(xì)菌中外來的DNA分子,限制、阻止細(xì)菌的侵染。已經(jīng)分離出200多種限制性內(nèi)切核酸酶，可分兩類每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子（無序列特異性）準(zhǔn)確識(shí)別雙鏈DNA特異序列（基因工程中廣泛應(yīng)用）

雙鏈中，識(shí)別的序列是對(duì)稱的：回紋對(duì)稱序列（palindrome）雙鏈DNA被切割后產(chǎn)生兩個(gè)相同的單鏈粘性末端（stikyend）EcoRⅠ

兩種片斷放在一起，適宜條件下，通過堿基互補(bǔ)——雙鏈DNA分子（通過氫鍵）DNA連接酶，形成磷酸二脂鍵，連接成重組的DNA分子切割后產(chǎn)生平齊單鏈粘性末端SmaⅠ切割后產(chǎn)生平齊末端，DNA連接酶，連接成重組的DNA分子酶切重組的DNA分子部分常用的限制性酶作用：經(jīng)過酶切的DNA片斷，只有和適合的載體（vecter）DNA連接構(gòu)成重組DNA分子，通過載體進(jìn)入宿主細(xì)胞（hostcell），在宿主細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增、克隆出多個(gè)拷貝?？勺鳛镈NA載體的有：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌、酵母人工染色體BAC、HAC等三、載體作為載體的DNA分子需具備的條件：具有復(fù)制原點(diǎn)（ori）,在宿主細(xì)胞中獨(dú)立自我復(fù)制，攜帶的外源DNA片斷一起復(fù)制。多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsite,MCS或polylinkerregion),具有多種限制性酶切的切點(diǎn)，每種酶切的切點(diǎn)只有一個(gè)，切點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)、抗生素選擇標(biāo)記基因內(nèi)。有選擇標(biāo)記（至少一個(gè)），抗生素、某種酶，而宿主中沒有這種基因容易從宿主細(xì)胞中回收。1.細(xì)菌質(zhì)粒獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在，自我復(fù)制、容易分離和導(dǎo)入，環(huán)狀雙鏈DNA分子。用于克隆分子量<10kb的外源DNA片斷，應(yīng)用范圍廣，拷貝數(shù)多。1000個(gè)1個(gè)復(fù)制后宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)重組型檢測(cè)標(biāo)記在DNA克隆中根據(jù)宿主表型質(zhì)粒是否帶外源DNA片斷Puc18

分子量?。ń邮茌^大片斷）、拷貝數(shù)多（500）、多克隆酶切位點(diǎn)（克隆方便）、α-互補(bǔ)顯色表型（檢測(cè)標(biāo)記）

菌落成藍(lán)色陽性克隆攜帶外源DNA沒有外源DNA全長49kb可接受15-23kb外源DNA片斷2.λ噬菌體2/3的序列為中間基因族DNA左臂DNA右臂可以被外源DNA片斷取代不影響噬菌體感染細(xì)菌、形成噬菌斑（centralgenecluster）導(dǎo)入限制性酶切點(diǎn)導(dǎo)入限制性酶切點(diǎn)DNA右臂DNA左臂DNA左臂可以被外源DNA片斷取代DNA右臂噬菌體蛋白包裝提取物轉(zhuǎn)導(dǎo)感染宿主菌株在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖、擴(kuò)增噬菌斑鑒定陽性克隆特點(diǎn)：克隆載體，表達(dá)載體用作cDNA、核DNA的克隆載體基因庫的篩選中，λ噬菌體作載體與細(xì)菌質(zhì)粒相比，容易操作、陽性克隆數(shù)多，用于各類基因庫的構(gòu)建3.柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒(cosmid):部分λ噬菌體DNA與部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建而成。組成（λ噬菌體的cos序列12bp、細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)）：cos序列：噬菌體DNA包裝成噬菌體時(shí)所必需的質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)：柯斯質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中同普通細(xì)菌質(zhì)粒一樣進(jìn)行自主復(fù)制抗生素抗性基因能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體既能在原核生物（如大腸桿菌），又能在真核生物（如酵母）中復(fù)制的載體。特點(diǎn)：細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因真核生物自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequence）、選擇標(biāo)記性狀應(yīng)用：在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增克隆的基因在酵母菌中用于基因表達(dá)分析種類：YEp系列載體、YIp、YCp、YRp系列載體4.穿梭載體（shuttlevecter）YEp

(yeastepisomalplasmid)：酵母菌附加體質(zhì)粒YEp

酵母菌附加體質(zhì)粒，其自主復(fù)制序列來自于酵母菌的內(nèi)源附加體2μ，使每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)保持在100個(gè)左右。兩個(gè)順式調(diào)控元件：在細(xì)胞分裂中，使細(xì)胞分配到的質(zhì)粒數(shù)相近?？股?Amp和Tc抗性及URA3(尿嘧啶)基因用于在酵母菌中選擇。兩個(gè)抗性基因序列內(nèi)，有可供克隆外源DNA片斷的酶切的位點(diǎn)外源基因插入失活轉(zhuǎn)化URA3-

酵母菌選擇陽性克隆5.細(xì)菌人工染色體

（Bacterialartificialchromsome,BAC）很多真核生物基因長度在50kb以上，前述載體不能攜帶大于50kb的外源基因片斷。設(shè)計(jì)構(gòu)建細(xì)菌人工染色體(Bacterialartificialchromsome,BAC)。

克隆100kb以上的DNA片斷帶有外源基因片斷的BAC載體，在細(xì)菌細(xì)胞中，通常是單拷貝——保持DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制，不發(fā)生重組。前述載體不能攜帶大于50kb的外源基因片斷?；蚬こ谈牧糂AC載體F因子6.酵母菌人工染色體

(Yeastartificalchromsome,YAC)適應(yīng)真核生物基因組分析，自主復(fù)制，可在細(xì)菌、酵母菌中選擇的標(biāo)記，克隆位點(diǎn)，100-1000kb的外源DNA片斷人類基因組計(jì)劃、圖位克隆分離基因的重要工具，促進(jìn)人類人工染色體（humanartificalchromsome,HAC）的研究7.Ti質(zhì)粒及其衍生載體利用基因工程技術(shù)改良植物性狀，需要將重組DNA運(yùn)載到植物細(xì)胞并使之表達(dá)。Ti質(zhì)粒衍生載體是最早成功的植物載體。特點(diǎn)：細(xì)菌質(zhì)粒，自然存在于一種根瘤土壤桿菌（革蘭氏陰性菌）（Agrobacteriumtumefaciens）細(xì)胞中根瘤土壤桿菌侵染與轉(zhuǎn)基因大多數(shù)雙子葉植物產(chǎn)生冠癭瘤獨(dú)立不受控制生長Ti質(zhì)粒：誘導(dǎo)瘤細(xì)胞根瘤土壤桿菌感染受傷部位冠癭堿碳源氮源T-DNA整合宿主細(xì)胞染色體Ti質(zhì)粒的特點(diǎn)5個(gè)主要功能區(qū)：T-DNA：質(zhì)粒轉(zhuǎn)移冠癭堿代謝復(fù)制原點(diǎn)毒性區(qū)

200-500克kb，環(huán)狀DNA分子很難用作DNA克隆載體進(jìn)行操作的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，以順反兩種方式調(diào)控T-DNA的轉(zhuǎn)移致瘤基因，與轉(zhuǎn)移無關(guān)誘導(dǎo)根瘤細(xì)胞根瘤細(xì)胞不能再生植株T-DNA卸甲抗性基因、外源基因重組T-DNALB++RB轉(zhuǎn)移、整合植物染色體再生轉(zhuǎn)基因植株直接參與轉(zhuǎn)移、整合LB,RB:T-DNA:Vir區(qū)Ti質(zhì)粒的衍生載體用于植物基因工程的兩套載體雙元載體（binaryvector）兩個(gè)質(zhì)粒：1一個(gè)質(zhì)粒，克隆外源基因片斷的克隆質(zhì)粒：在大腸桿菌、根瘤土壤桿菌中復(fù)制，可在兩者之間轉(zhuǎn)移，也是一種穿梭質(zhì)粒。2另一個(gè)質(zhì)粒，以與pBin19匹配使用的pAL4404為例（pAL4404為非致病Ti質(zhì)粒）沒有T-DNA，只有Ti質(zhì)粒的毒性區(qū)，以反式調(diào)控的方式調(diào)控轉(zhuǎn)所質(zhì)粒上的T-DNA的轉(zhuǎn)移。3兩個(gè)質(zhì)粒分別導(dǎo)入根瘤土壤根菌后，經(jīng)根瘤土壤桿菌介導(dǎo)，克隆質(zhì)粒中的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組中。共整合載體包括兩個(gè)質(zhì)粒：一個(gè)用于克隆外源基因，如pMON200

另一個(gè)帶有毒性基因，如pTIB6S3-SE兩個(gè)質(zhì)粒有一段同源序列，在根瘤土壤桿菌中經(jīng)過重組整合成一個(gè)載體，稱共整合載體另外：還有一類用于植物基因工程的載體，不經(jīng)根瘤土壤桿菌介導(dǎo)，在物理及化學(xué)方法的作用下，將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，整合導(dǎo)植物基因組中。它與穿梭質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)類似。如：pAHC25主要用于單子葉植物。一個(gè)基因是編碼一條多肽鏈的一個(gè)DNA片斷，包括啟動(dòng)子、終止子及內(nèi)含子?；虻姆蛛x與鑒定是DNA重組的關(guān)鍵步驟之一。分離的基因可用于分析基因序列、結(jié)構(gòu)與表達(dá)，為基因工程提供目的基因。四、基因的分離與鑒定（1）構(gòu)建基因庫（library）基因庫（library）是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因首先要構(gòu)建基因庫?；驇炜煞譃椋汉嘶驇?、染色體庫、cDNA庫、線粒體庫等1.從基因庫中分離基因核基因庫（genomiclibrary/bank）將某一生物的全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的全部DNA+=酶切核基因庫感染寄主細(xì)胞感染寄主細(xì)胞感染寄主細(xì)胞感染寄主細(xì)胞感染寄主細(xì)胞感染寄主細(xì)胞感染寄主細(xì)胞染色體基因庫

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