酶工程 第九章 酶分子修飾

酶分子修飾ModificationofEnzymeMolecule

限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因1.易于變性失活（酸、堿、有機(jī)溶劑、熱）；2.容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制；3.底物不溶于水，或酶的米氏常數(shù)過高；4.酶做為藥物在體內(nèi)的半衰期較短；5.已知酶種類及產(chǎn)物有限。1.通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性?！鞍踪|(zhì)水平2.通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的?！怂崴?/p>

改變酶特性的兩種主要方法

酶分子修飾：通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的技術(shù)。知識回顧：酶的活性中心酶分子修飾的目的酶分子修飾的種類修飾酶的化學(xué)性質(zhì)酶分子修飾的應(yīng)用主要內(nèi)容

一、活性中心的概念酶分子中的一小部分區(qū)域——

由酶分子中少數(shù)氨基酸殘基參與組成與底物發(fā)生結(jié)合和催化作用與酶活力直接相關(guān)

第一節(jié)酶的活性中心（activecenter）二、酶活性中心的共性

1.酶的活性中心是由必需基團(tuán)(essentialgroup)構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域，其構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。Theactivesiteistheregionoftheenzymethatbindsthesubstrate,toformanenzyme-substratecomplex,andtransformsitintoproduct.酶分子非必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性中心必需基團(tuán)活性中心外必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)非活性中心活性中心7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高:Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr、Ser某些功能基團(tuán)（如氨基、羧基、巰基、咪唑基和羥基）是酶的必需基團(tuán)。

活性中心的重要化學(xué)基團(tuán)半胱氨酸谷氨酸絲氨酸組氨酸天冬氨酸賴氨酸酪氨酸2.活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。3.活性部位是一個三維實體。Theactivesiteisoftenacleft

orcreviceonthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundbymultipleweakinteractions.4.活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。5.酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級鍵結(jié)合。1.物理學(xué)方法2.化學(xué)修飾法3.動力學(xué)參數(shù)法4.蛋白質(zhì)工程

三、研究酶活性中心的方法

用X射線衍射法直接檢測底物或其類似物與酶形成的中間復(fù)合物（包括酶和底物）的相對位置。

1.物理學(xué)方法2.化學(xué)修飾法根據(jù)所用修飾試劑不同，分為:

1)非專一性化學(xué)修飾用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用。若修飾后：

酶活性不變——修飾基團(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán)

酶活性降低或喪失——修飾基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)，但不能確定是否同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合。2)專一性化學(xué)修飾基團(tuán)專一性修飾用專一性化學(xué)修飾劑修飾酶分子中的某一特定氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。位點(diǎn)專一性修飾(親和標(biāo)記）利用酶對底物的特殊親和力修飾酶分子活性中心的某一特定氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。

親和修飾劑：①與底物結(jié)構(gòu)相似，與活性中心的氨基酸殘基親和力大，而與活性中心以外的氨基酸殘基親和力小。②具有活潑的化學(xué)基團(tuán)（如鹵素）可與活性中心的基團(tuán)形成穩(wěn)定的共價鍵。親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾）化學(xué)修飾的專一性3.動力學(xué)參數(shù)法

pH-酶活力關(guān)系的研究，可得到參與反應(yīng)的必需基團(tuán)的pK值，通過比較分析估計基團(tuán)的種類。4.蛋白質(zhì)工程將酶相應(yīng)的cDNA定點(diǎn)突變，突變的cDNA只表達(dá)一個或幾個氨基酸被置換的酶蛋白，測定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需。一、酶分子修飾的目的1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（上世紀(jì)50年代）探測酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的測定酶蛋白的結(jié)構(gòu)變化與運(yùn)動酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)酶的作用機(jī)理與催化反應(yīng)歷程酶分子的拓?fù)鋵W(xué)以及寡聚酶的亞基結(jié)合狀態(tài)酶的固定化技術(shù)酶純度的分析與檢測第二節(jié)酶分子修飾的目的和原理2.人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍（上世紀(jì)70年代）1.提高酶的生物活性（酶活力）2.增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）3.消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）4.產(chǎn)生新的催化能力第三節(jié)酶分子修飾的種類一、金屬離子置換修飾二、酶分子的化學(xué)修飾三、酶分子的物理修飾一、金屬離子置換修飾P136（metalionsubstitutemodification）

將酶分子中的金屬離子置換為另一種金屬離子，使其催化特性發(fā)生改變的修飾方法。1.方法：

酶的分離純化

除去原有金屬離子：加入金屬螯合劑，去除螯合物加入置換離子2.作用：闡明金屬離子對酶催化作用的影響提高酶的催化效率增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性

改變酶的動力學(xué)特性1.酶的表面化學(xué)修飾（1）大分子結(jié)合修飾（2）側(cè)鏈基團(tuán)修飾（小分子修飾）（3）交聯(lián)法（4）固定化修飾（共價結(jié)合法）2.酶分子內(nèi)部修飾（1）肽鏈有限水解修飾（2）核苷酸鏈剪切修飾（3）氨基酸置換修飾（4）核苷酸置換修飾二、酶分子的化學(xué)修飾（1）大分子結(jié)合修飾P138（macromoleculescombinemodification）

利用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法。

修飾劑：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、糖肽（glycopeptide）等。

修飾方法：修飾劑選擇，修飾劑活化，修飾，分離。①聚乙二醇的修飾反應(yīng)聚乙二醇（PEG，Mw1000-10000）：線性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性。單甲氧基聚乙二醇（MPEG）：

CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH修飾方法：重氮法、疊氮法、琥珀酸酐法、三氯均三嗪法。重氮法疊氮法琥珀酸酐法三氯三嗪法例：聚乙二醇化學(xué)修飾超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶(SOD)：生物體內(nèi)重要的自由基清除劑，催化超氧陰離子(O2-)的歧化反應(yīng)，能緩解許多由自由基介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕組織缺血性損傷，預(yù)防和治療輻射損傷。臨床應(yīng)用：延緩人體衰老，防止色素沉著，消除局部炎癥，特別是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及輻射防護(hù)。缺陷：半衰期短、穩(wěn)定性差、免疫原性。SOD作用機(jī)制修飾方法修飾劑選擇：單甲氧基PEG(mPEG)修飾劑活化：烷基化修飾：活化后的修飾劑與蛋白上賴氨酸殘基的ε-氨基或N末端氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的連接體分離：凝膠層析效果：抑制免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，提高抗酶水解能力，延長半衰期修飾原理PEG與蛋白的非必需基團(tuán)結(jié)合后，分子表面形成一個PEG保護(hù)層，作為一種屏障擋住蛋白分子表面的抗原決定簇，避免抗體的產(chǎn)生或者阻止抗原和抗體的結(jié)合而抑制免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。由于這種保護(hù)層的形成保護(hù)了該酶免受體內(nèi)水解酶的消化，表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗酶水解能力。蛋白經(jīng)PEG修飾后分子量增加，分子的體積增大，腎小球過濾減少，可以避免被腎臟很快地排除，因而其血漿存留時間得到顯著延長，有助于蛋白藥物循環(huán)半衰期的延長。②糖類的修飾反應(yīng)：右旋糖苷修飾反應(yīng)右旋糖苷：

-葡萄糖通過-1,6-糖苷鍵連接而成，雙羥基經(jīng)過活化后可與酶分子上的游離氨基相結(jié)合。修飾方法：溴化氰法、高碘酸氧化法。-NH2糖肽（Glycopeptide）的修飾反應(yīng):

糖肽：人纖維蛋白或-球蛋白經(jīng)蛋白酶水解后得到的產(chǎn)物，分子上的游離氨基活化后可與酶分子上的氨基反應(yīng)。修飾方法：異氰酸法、戊二醛法。聚乳糖修飾反應(yīng)：聚乳糖在一定溫度下，通過適當(dāng)?shù)倪€原劑可與酶分子上氨基反應(yīng)。③其他合成大分子多聚物的修飾反應(yīng)(1)聚N-乙烯吡硌烷酮(PVP):用水溶性的分子量為10,000的PVP，經(jīng)過開環(huán)水解活化后，與酶結(jié)合。(2)聚乙烯醇(PVA):PVA與對硝基苯氧酰氯反應(yīng)，其硝基再用連二亞硫酸鈉還原為氨基，與酶分子中的羧基共價連接。(3)聚丙烯酸(PAA):用分子量為250,000的PAA，經(jīng)過N-羥基琥珀酰亞胺活化后與酶的氨基反應(yīng)。(4)聚順丁烯二酸酐:用分子量為98,000的聚順丁烯二酸酐，可以直接與酶分子的氨基發(fā)生反應(yīng)。(5)聚氨基酸：用分子量為5,700的聚賴氨酸做修飾劑時，其氨基與酶分子上的羧基通過羰二亞胺產(chǎn)生交聯(lián)。用丙氨酸的二肽或三肽做修飾劑時，其酸酐可以與酶發(fā)生反應(yīng)。④天然大分子對酶的修飾反應(yīng)肝素由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量約為20000，是一種含硫酸酯的黏多糖。經(jīng)過肝素修飾的酶具有良好的穩(wěn)定性，不僅可以提高酶的療效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。修飾方法：三氯三嗪法、溴化氰法④天然大分子對酶的修飾反應(yīng)人血清白蛋白：包含585個氨基酸，分子量為66kD

臨床應(yīng)用：治療休克與燒傷，用于補(bǔ)充因手術(shù)、意外事故或大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增容劑修飾方法：戊二醛法、活性酯法提高酶的催化效率水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價結(jié)合后，一定程度上改變了酶的空間構(gòu)象，有利于活性中心與底物結(jié)合并發(fā)揮催化作用⑤大分子結(jié)合修飾的作用增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性——修飾劑與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)，使酶的天然構(gòu)象“剛性”增加。保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑——大分子修飾劑產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑。維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶——大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶；敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后受蛋白水解酶破壞的可能性減小。

穩(wěn)定酶的微環(huán)境——大分子修飾劑（多聚電荷體）在酶分子表面形成“緩沖外殼”增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。

破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除

遮蓋了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合降低或消除酶蛋白的抗原性⑥大分子結(jié)合修飾的應(yīng)用

PEG-超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）

PEG-溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶Streptokinase,SK;尿激酶urokinase,UK等）

PEG-天門冬酰胺酶（Asparaginase,ASNase）消除了抗原性延長了酶在體內(nèi)的半衰期用Dextran修飾

-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、過氧化氫酶：提高了酶的熱穩(wěn)定性。（2）側(cè)鏈基團(tuán)修飾（小分子修飾）P141（sideresiduesmodification）通過化學(xué)修飾劑使酶分子側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的修飾方法。

側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基等。

20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。

側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：小分子化合物

根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。非極性R基氨基酸（共9種）：甘氨酸(Glycine,Gly,G)

丙氨酸(Alanine,Ala,A)

亮氨酸(Leucine,Leu,L)

纈氨酸(Valine,Val,V)

異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I)

苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F)

脯氨酸(Proline,Pro,P)色氨酸(Tryptophan,Trp,W)

甲硫氨酸(Methionine,Met,M)

無電荷的極性R基氨基酸（共6種）：絲氨酸(Serine,Ser,S)

蘇氨酸(Threonine,Thr,T)

酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y)

半胱氨酸(Cysteine,Cys,C)

天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)

谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)

帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴氨酸(Lysine,Lys,K),

精氨酸(Arginine,Arg,R),

組氨酸(Histidine,His,H)帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),

谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E)烷基化反應(yīng)酰化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)①幾種重要的修飾反應(yīng)烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如-NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys），胍基（Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），咪唑基（His）。修飾劑：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)試劑特點(diǎn)：含有結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?。可作用基團(tuán)：氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）修飾劑：乙酰咪唑、二異丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯等?；磻?yīng)氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基、甲硫基、吲哚基、咪唑基、酚基等。還原劑：2-巰基乙醇、DTT等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化、硝化試劑

（四硝基甲烷）I2++HI(NO2)4C+

+(NO2)3CH②特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾：來源：Lys修飾反應(yīng)：酰基化、烷基化修飾劑:

三硝基苯磺酸（TNBS）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等三硝基苯磺酸2,4-二硝基氟苯碘乙酸羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸，可定量測定酶分子中羧基的數(shù)目。+碳二亞胺巰基的化學(xué)修飾

來源：Cys

修飾反應(yīng):烷基化修飾劑：碘乙酸(IAA)

碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-XE-S-R+HXN-乙基馬來酰亞胺（NEM）：常用的專一修飾巰基試劑E-SH+

胍基的化學(xué)修飾來源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對氨基?；?。修飾劑：丁二酮二羰基化合物1，2-環(huán)己二酮苯乙二醛酚羥基的化學(xué)修飾來源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）I2++HI咪唑基的化學(xué)修飾

來源：His

修飾反應(yīng):酰基化、烷基化

?；揎梽?焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）

+

+C2H5OH+CO2

烷基化修飾劑：碘乙酸+ICH2COOH

+HI吲哚基的化學(xué)修飾

來源：Trp

修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾劑：

N-溴代琥珀酰亞胺二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp/Glu羧基水溶性碳二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2-環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺

各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑

對修飾效果的解釋須十分小心：①任何一種修飾劑不是絕對專一的。②有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化——失活，不一定是活性中心基團(tuán)被共價修飾。③不同部分的相同基團(tuán)，修飾效