蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)

蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)

蝴蝶蘭是蘭花科多年生附生草本植物?；ǘ涿利?，結(jié)構(gòu)精細(xì)而獨(dú)特，顏色各異，花期長(zhǎng)。它以“蘭皇木蘭”的聲譽(yù)而聞名，具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)需求量大。蝴蝶蘭為單莖性氣生蘭,植株極少發(fā)生側(cè)芽,常規(guī)的分株繁殖困難,而種子在自然環(huán)境中難以萌發(fā),無法滿足市場(chǎng)對(duì)蝴蝶蘭種苗的大量需求。長(zhǎng)期以來,科研工作者不斷探索蝴蝶蘭優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖的方法,并取得了矚目的成績(jī)。組織培養(yǎng)已經(jīng)成為蝴蝶蘭種苗繁殖最好的方法,1949年RotorG成功報(bào)道利用花梗腋芽獲得試管苗到現(xiàn)在利用蝴蝶蘭種苗的根、莖、葉等進(jìn)行批量生產(chǎn)獲得克隆種苗,滿足了市場(chǎng)對(duì)蝴蝶蘭種苗的需求。本文概述了近年來蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)的研究進(jìn)展,以期為蝴蝶蘭的生產(chǎn)發(fā)展提供參考。1苗木移栽三階段蝴蝶蘭組培的過程一般分為外植體誘導(dǎo)、繼代增殖、壯苗、生根、健化移栽5個(gè)階段。目前,國(guó)內(nèi)外蝴蝶蘭組培研究主要集中在外植體選擇、基本培養(yǎng)基選擇、植物激素種類和配比濃度、組培環(huán)境等方面。1.1外生體關(guān)于蝴蝶蘭組培外植體選擇方面的報(bào)道較多,且各有優(yōu)缺點(diǎn),主要常見外植體見表1。1.2通過培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)蝴蝶蘭組培繁殖通常有無菌播種、類圓球莖(PLBs)、叢生芽三大途徑。蝴蝶蘭種子細(xì)小,自然條件下很少萌發(fā),而通過無菌播種,種胚可膨大為圓球莖,后繼續(xù)分化成實(shí)生苗,從而達(dá)到繁殖目的。按播種方式,無菌播種可分為裂莢播種和未裂莢播種兩類,裂莢播種不容易消毒,而未裂果莢要求有足夠的成熟度,多為授粉后發(fā)育4個(gè)月左右的果莢。蝴蝶蘭無菌播種常用花寶一號(hào)、Kyoto和MS培養(yǎng)基,形成的原球體及其后小苗發(fā)育可在同一種培養(yǎng)基中培養(yǎng);對(duì)于一些原生種的種子,在培養(yǎng)基中最好不添加活性炭及香蕉泥,否則原球體易白化或黃化死亡。雖然蝴蝶蘭種子量大且易得,但所獲得的后代植株性狀不一、變異性大,商業(yè)價(jià)值低,不宜大量生產(chǎn)。該方法較適用于不會(huì)產(chǎn)生分離的品種或原生種,或應(yīng)用于育種。類圓球莖是蘭科植物組織培養(yǎng)中產(chǎn)生的特有現(xiàn)象,可以通過花梗腋芽、幼葉、根尖、莖尖等部位直接誘導(dǎo),也可以先誘導(dǎo)愈傷組織,再?gòu)挠鷤M織誘導(dǎo)類圓球莖。據(jù)報(bào)道,誘導(dǎo)類圓球莖的材料來源廣泛,但不同外植體使用的培養(yǎng)基成分均不同。一般以葉片、莖尖誘導(dǎo)類圓球莖最易,根尖、根段最難。國(guó)內(nèi)王懷宇等提出的叢生芽途徑,是指通過誘導(dǎo)類圓球莖直接誘導(dǎo)叢生芽來穩(wěn)定遺傳母本特性,減少變異的方法,具有技術(shù)難度低、遺傳穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。一般采用花梗中上部位的飽滿腋芽作為外植體,誘導(dǎo)率高,每個(gè)腋芽可以誘導(dǎo)出1～3個(gè)芽。叢生芽途徑的開辟,加速了蝴蝶蘭組培苗工廠化生產(chǎn)的進(jìn)程,成為目前蝴蝶蘭無性繁殖的主要途徑。在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)根據(jù)自身?xiàng)l件和目的,選擇合適的外植體和誘導(dǎo)途徑。外植體雖多種多樣,但消毒處理的方法類似,常選用的消毒試劑有75%的酒精、0.1%升汞、1%次氯酸鈉溶液、雙氧水等,消毒時(shí)間也從數(shù)秒到20min不等。2培養(yǎng)基和激素2.1對(duì)三大苗木枝的誘導(dǎo)蝴蝶蘭組織培養(yǎng)所采用的基本培養(yǎng)基包括MS、B5、花寶、KC及其改良型等,其中MS基本培養(yǎng)基最為常用。楊美純等研究發(fā)現(xiàn),MS最適合蝴蝶蘭種子萌發(fā),王慧俞等則認(rèn)為KC最適,曾宋君等研究認(rèn)為花寶1號(hào)、花寶2號(hào)明顯優(yōu)于1/2MS、MS和KC等。魯雪華等在花梗節(jié)間切段誘導(dǎo)類原球莖的試驗(yàn)中認(rèn)為,1/2MS和改良MS比MS效果要好。廖福琴研究認(rèn)為,對(duì)V31品種的幼嫩花梗誘導(dǎo)最佳基本培養(yǎng)基是MS。周俊輝等以紅花品種蝴蝶蘭為材料,對(duì)比MS、1/2MS和改良KC對(duì)類圓球莖的增殖效果,結(jié)果表明:改良KC效果最好,MS最差?？梢?選擇最適培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)不同品種、不同外植體和培養(yǎng)階段對(duì)組分及其濃度加以修改,最好根據(jù)培養(yǎng)過程中原球莖或試管苗的生長(zhǎng)情況及時(shí)調(diào)整。2.2激素配比對(duì)植物基人原球莖增殖的影響有研究表明,單獨(dú)使用生長(zhǎng)素不能誘導(dǎo)出叢生芽,只有在生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素同時(shí)存在時(shí),才能誘導(dǎo)出叢生芽,由此可見激素種類和濃度配比非常關(guān)鍵。蝴蝶蘭組培中6-BA濃度為0.1～10.0mg/L,NAA使用濃度為0.05～5.00mg/L。培養(yǎng)基類型及激素種類和濃度會(huì)因品種和培養(yǎng)階段的差異而各不相同。對(duì)于某一品種的誘導(dǎo)階段和增殖階段,所用基本培養(yǎng)基和激素配比可大致相同,在壯苗生根階段則會(huì)減少激素用量甚至不添加激素。研究認(rèn)為,在類原球莖的誘導(dǎo)階段,添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)類原球莖的誘導(dǎo)有利,添加細(xì)胞分裂素對(duì)原球莖的分化有促進(jìn)作用。低濃度6-BA利于類原球莖增殖,而高于6.0mg/L的6-BA刺激多酚氧化酶作用,使類原球莖產(chǎn)生褐化。也有研究認(rèn)為,1～8mg/L的6-BA能促進(jìn)蝴蝶蘭類原球莖增殖,而濃度為0.1～0.5mg/L的6-BA則能促進(jìn)類原球莖的分化。生根誘導(dǎo)時(shí)只需生長(zhǎng)素即可。何子育等則認(rèn)為在增殖、生根與壯苗階段不需加任何激素。彭立新等研究表明:在MS培養(yǎng)基中添加6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L有利于原球莖體的誘導(dǎo),激素配比為6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭1.0g/L有利于原球莖體的增殖、提高增殖系數(shù),且不用轉(zhuǎn)接就可直接生根成苗,避免轉(zhuǎn)接過程帶來的污染損失,簡(jiǎn)化了培養(yǎng)過程。曹君邁等對(duì)比了不同生長(zhǎng)素對(duì)分枝型蝴蝶蘭種胚離體培養(yǎng)的影響,認(rèn)為NAA在1.0～1.5mg/L濃度范圍內(nèi),比IBA更利于圓球莖的生長(zhǎng)發(fā)育。除上述兩類激素外,GA3在組培中也有應(yīng)用:它對(duì)圓球莖分化有一定的抑制作用,可保持圓球莖的增殖能力。2.3使用高效糖代謝培養(yǎng)一般情況下,蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑,是首選碳源。為節(jié)約生產(chǎn)成本,也可以用白糖、片糖等代替,效果有時(shí)比蔗糖還好。曾宋君等認(rèn)為繼代培養(yǎng)時(shí)所需的碳源濃度比初代增殖與生根壯苗階段高,與謝峰的研究結(jié)論相反。培養(yǎng)基中糖濃度過高時(shí),會(huì)為微生物生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造條件,因此降低糖濃度可以一定程度上降低污染率,還能夠阻礙乙烯的生物合成,并提高試管苗移栽成活率,但降低糖濃度有使植株生長(zhǎng)瘦弱、培養(yǎng)期延長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)。近年來,關(guān)于代替?zhèn)鹘y(tǒng)糖類碳源的新型CO2無糖式光合培養(yǎng)模式逐漸成為研究熱點(diǎn)。提高培養(yǎng)容器內(nèi)CO2濃度主要采用增加容器透氣性或利用一些特殊的裝置將CO2直接或間接導(dǎo)入容器的方法。該方法要求培養(yǎng)材料必須含有一定的葉綠素來進(jìn)行光合作用自養(yǎng),前期需要一定的設(shè)備投入。2.3.2活性炭對(duì)植物的生長(zhǎng)作用用于清除植物組織在代謝過程中產(chǎn)生的不利或具毒副作用的物質(zhì),亦可調(diào)節(jié)激素的供應(yīng),促進(jìn)植物生長(zhǎng)。多數(shù)研究認(rèn)為活性炭具有減緩褐化和促進(jìn)生根的作用。在生根培養(yǎng)基中加入活性炭能抑制Ca+的吸收和防止褐變,有利于根的形成和生長(zhǎng),獲得根系較好的生根苗。周俊輝等研究表明,低濃度(0.5～1.0g/L)活性炭對(duì)原球莖增殖不明顯,高濃度(2.0～3.0g/L)時(shí)能促進(jìn)原球莖增殖,但出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。需要注意的是,活性炭的吸附性是無選擇性的,不僅吸附有害物質(zhì)也能吸附激素,使用過程中要掌控好用量,使其既能最大程度的吸附有害物質(zhì),促進(jìn)生根,又不影響植物的正常發(fā)育。另外,還需注意活性炭對(duì)培養(yǎng)基pH值有緩沖作用。2.3.3種常用植物的殺菌處理及對(duì)比研究為解決或防止有害微生物如細(xì)菌、真菌等侵染培養(yǎng)基造成污染發(fā)生,常在培養(yǎng)基中加入一些抑菌物質(zhì)。顧偉民等曾在蝴蝶蘭組培中,利用抗生素和醫(yī)用殺菌劑混合得出1種應(yīng)用多種植物的殺菌劑處理污染苗。抑菌物質(zhì)也可對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理或作為消毒接種工具。崔剛等從多種植物中提取具有殺菌、抗菌活性的物質(zhì),研制出具有廣譜性殺菌能力的抑生素,以此替代常規(guī)高溫高壓蒸汽滅菌環(huán)節(jié),降低成本。但是抗生素各有其抑菌譜,不同外植體所適宜的抗生素種類也不一樣,它們對(duì)組培苗生理生化作用及變異率的影響、怎樣最大程度的降低污染率等問題,仍需要在實(shí)踐中探索。2.3.4添加香蕉汁和椰子汁對(duì)原球莖生長(zhǎng)的影響在蝴蝶蘭組培中,適當(dāng)加入一些有機(jī)質(zhì)或天然物質(zhì),對(duì)誘導(dǎo)、增殖、生根都有很好的促進(jìn)作用。王靜等研究發(fā)現(xiàn)水解酪蛋白對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖有明顯促進(jìn)作用,但水解酪蛋白和香蕉勻漿混合卻對(duì)原球莖增殖有抑制作用。何松林等以白色花系蝴蝶蘭的原球莖為材料,研究了椰子汁、馬鈴薯汁和香蕉汁對(duì)原球莖幼苗分化的影響,結(jié)果表明,3種添加物均可提高原球莖的增殖率,其中椰子汁和馬鈴薯汁的效果優(yōu)于香蕉汁。王立婭依據(jù)中醫(yī)理論,添加5.5g/L蝴蝶蘭葉片勻漿研究其對(duì)增殖效果的影響,發(fā)現(xiàn)增殖效果顯著好于香蕉泥、椰汁。3培訓(xùn)方法和條件3.1培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的作用組織培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。培養(yǎng)基的形態(tài)對(duì)組織、細(xì)胞等外植體的生長(zhǎng)過程、生長(zhǎng)速度具有較大影響。通常情況下,固體培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)愈傷組織,而液體培養(yǎng)則有利于細(xì)胞和胚狀體增殖。在蝴蝶蘭的整個(gè)生產(chǎn)過程中,利用半固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)進(jìn)行原球莖增殖,利用固體培養(yǎng)分化和生根,可增加繁殖系數(shù),降低污染,減少成本,有利于大規(guī)模生產(chǎn)。3.2光照、培養(yǎng)以及微生物環(huán)境的影響在蝴蝶蘭組培中,光照、溫度等環(huán)境因素對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)都有很大的影響。不同光譜的LEDs對(duì)蝴蝶蘭組培苗形態(tài)指標(biāo)、色素含量、抗氧化酶系活性等都有影響。單色紅光處理的蝴蝶蘭組培苗徒長(zhǎng),單色藍(lán)光處理的組培苗根系活力最高。紅藍(lán)組合和單色藍(lán)光處理的葉片色素含量高于白光,可溶性糖、蔗糖、游離氨基酸和淀粉的含量及C/N(碳氮比)在單色藍(lán)光下均高于單色紅光處理。紅光能夠增加鮮重、干重,但會(huì)減少蝴蝶蘭葉綠素含量,不同光譜對(duì)根長(zhǎng)的影響差異不顯著。陳菁瑛等認(rèn)為在蝴蝶蘭葉片培養(yǎng)中,500lx光照培養(yǎng)有利于類原球莖的形成,1000lx或者完全黑暗條件不利于類原球莖誘導(dǎo)。一般常見的光照強(qiáng)度范圍為1000～2000lx。組培過程中溫度過低,形成類原球莖狀體所需時(shí)間較長(zhǎng),生長(zhǎng)較慢;溫度過高,容易造成污染且易褐變。研究表明,蝴蝶蘭試管苗培養(yǎng)的適宜溫度為25℃,也有文獻(xiàn)指出花梗腋芽誘導(dǎo)時(shí),25℃下容易出現(xiàn)花梗芽,28℃可以全部轉(zhuǎn)換為葉芽。生產(chǎn)中多為26(±2)℃。偏酸性的培養(yǎng)基更適合蝴蝶蘭生長(zhǎng)發(fā)育,pH值多為5.0-6.5之間,在pH值5.0～5.4的環(huán)境中類原球莖生長(zhǎng)最好,過酸或近中性的環(huán)境都不合適。經(jīng)過高溫滅菌后,培養(yǎng)基的pH值會(huì)降低,配制培養(yǎng)基時(shí)需注意。類原球莖增殖時(shí)切割或針刺有利于增殖而控制分化,否則類原球莖很容易分化和生根,增殖時(shí)切塊應(yīng)≥3mm,過小易褐化死亡。還有一些關(guān)于培養(yǎng)微環(huán)境如CO2、乙烯氣體的研究,包括在培養(yǎng)過程中,這些氣體的變化過程以及如何通過調(diào)節(jié)氣體來改善培養(yǎng)效果。此外,射線輻射對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育也有作用,Tanaka等認(rèn)為0.2T的磁場(chǎng)系統(tǒng)能顯著增加類圓球莖的鮮重和干重。4植物生根壯苗蝴蝶蘭增殖與誘導(dǎo)常使用相似的培養(yǎng)基,養(yǎng)分濃度和激素水平變化不大。對(duì)于不同品種、不同外植體來說,沒有特別固定的培養(yǎng)基。如靖晶認(rèn)為最適合蝴蝶蘭叢生芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方是MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L+100g/L香蕉泥,而譚巍等則認(rèn)為是改良KC+NAA0.5mg/L+6-BA7mg/L+食用糖20g/L+瓊脂10g/L+活性炭2g/L。生根壯苗階段培養(yǎng)基傾向不加或少加激素,壯苗與生根也可以合為一個(gè)環(huán)節(jié)同時(shí)進(jìn)行,培養(yǎng)時(shí)間常為2個(gè)多月。林宗鏗等對(duì)蝴蝶蘭生根壯苗的研究發(fā)現(xiàn),無機(jī)鹽是影響叢生芽發(fā)根率的主要因素,蔗糖次之,NAA與多效唑影響較弱,蝴蝶蘭生根壯苗最佳培養(yǎng)基為:花寶1號(hào)3.5g/L+NAA1mg/L+蔗糖25g/L+香蕉泥100g/L+蛋白胨2g/L+活性炭1g/L。朱紅華等認(rèn)為生根培養(yǎng)基MS+NAA1mg/L+活性炭1.5g/L最好,這可能跟試驗(yàn)品種或所選的基本培養(yǎng)基不同有關(guān)。蝴蝶蘭組培瓶苗煉苗方式采用室內(nèi)與室外結(jié)合3d+3d、4d+4d效果較佳。常用的移栽基質(zhì)包括水苔、椰絲、草炭等單一或混合基質(zhì),以水苔效果最好。有研究利用當(dāng)?shù)爻Ｒ姷乃舍?、松樹皮等代替水苔作為移栽基質(zhì),也有很高的成活率。楊少輝等研究表明,蝴蝶蘭適合水培移栽,大量元素配方為Ca(NO3)2·4H2O354mg/L+KNO3177mg/L+KH2PO457.5mg/L+MgSO4.7H2O185mg/L。5培養(yǎng)基及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等對(duì)褐變的控制褐化是蝴蝶蘭組培中最為常見的問題。有關(guān)蝴蝶蘭組培褐變機(jī)理的研究多集中在褐變過程中總酚含量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性變化上。多數(shù)研究認(rèn)為,褐變與總酚含量及PAL、PPO和POD活性呈正相關(guān)。趙瀅等對(duì)3個(gè)蝴蝶蘭品種(B3、15、F5)總酚含量的測(cè)定結(jié)果表明,F5品種總酚含量高,但褐變程度最輕,與上述結(jié)論不一致。印芳等研究不同元素對(duì)初代培養(yǎng)中褐變的影響發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中Fe、Cu濃度越高,褐化越嚴(yán)重;培養(yǎng)基中K、Ca、Zn隨濃度升高褐變?cè)捷p。常用的控制褐化的方法為在培養(yǎng)基中加入抑制褐化劑及控制培養(yǎng)條件等。抑制褐化劑主要分兩大類:活性炭、檸檬酸、聚乙烯毗咯烷酮(PVP)等吸附劑和維生素C、谷朧甘膚等抗氧化劑,生產(chǎn)應(yīng)用較多的是活性炭和PVP。培養(yǎng)條件上主要有黑暗培養(yǎng)和熱激處理。以培養(yǎng)基pH值6.5、培養(yǎng)溫度20℃、培養(yǎng)期間光強(qiáng)為1000lx、預(yù)暗培養(yǎng)10d以及接種前對(duì)外植體雙層膜遮光的減輕褐化效果較