煙草內(nèi)生細菌的篩選與漂浮育苗試驗

煙草內(nèi)生細菌的篩選與漂浮育苗試驗

植物是一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng)。健康植物體內(nèi)存在大量的內(nèi)生細菌。這些內(nèi)生細菌可以促進植物的生長，提高植物抗病能力，保持植物良好的生長狀態(tài)，提高植物自身的抗病能力。前人研究還表明,內(nèi)生細菌可以通過生物固氮活化并促進植物對營養(yǎng)元素如氮磷鉀等大量元素和鐵等微量元素的吸收,產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)刺激調(diào)節(jié)植物生長,如植物激素、酸性物質(zhì)以及維生素等,提高植物抗旱性、抗鹽堿性、抗極端溫度和pH值、抗重金屬毒害等,提高宿主植物的逆境生存能力,對植物病害具有防治作用等。目前對內(nèi)生促生菌的篩選和使用主要在水稻苗、棉花、白菜上有一些研究,在煙草上尚未見報道。如能從煙草體內(nèi)篩選出對煙草生長有促進作用的有益菌,可為內(nèi)生促生菌的促生長作用原理的研究提供技術基礎。鑒于云南生態(tài)多樣性,生物多樣性,微生物種類多,煙草種植面積大的特點。筆者對云南省主栽煙草品種大量采樣,從煙草的不同組織中分離出多種內(nèi)生細菌,從中篩選出了對煙草有促生作用的菌株,并對其在煙草漂浮育苗中的應用效果進行了初步研究,以期將促生效果最佳的菌株應用于煙葉生產(chǎn)中。1材料和方法1.1苯丙克氏體的特性烤煙品種K326裸種由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供;煙草內(nèi)生細菌為2010年采用平板稀釋法從云南省不同煙區(qū)、不同煙草品種、不同生長期的葉及成熟期的根、莖分離獲得。1.2內(nèi)生細菌dna提取、擴增、dntps、wolbachis產(chǎn)品內(nèi)生細菌的活化用NA、液體培養(yǎng)用LB。內(nèi)生細菌DNA提取、16SrDNA片段擴增、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程產(chǎn)品。1.3生物促生細菌的篩選1.3.1種子萌發(fā)率的測定斜面保存的菌種在NA平板上活化后接種到LB培養(yǎng)液中,于28℃,200r/min的搖床中培養(yǎng)48h后,制成108cfu/mL濃度的菌懸液備用(在600nm處調(diào)整菌懸液光密度為0.5±0.02)。挑選飽滿、大小一致的K326裸種,70%的酒精消毒1分鐘,無菌水清洗3次后均勻播于鋪有2層濾紙的9cm無菌培養(yǎng)皿中,每皿注入稀釋10倍的上述菌懸液4mL,每20粒種子為一個重復,每菌株3次重復,設置清水對照和LB培養(yǎng)液對照,置于人工智能氣候箱中培養(yǎng),(光強:70%;光照:12h/d;晝夜溫度:25℃;相對濕度:70%)每隔1d補充無菌水1mL,以確保種子正常萌發(fā),于第7天分別統(tǒng)計發(fā)芽率,第14天測量煙苗根長、根體積。根長及根體積的測量采用加拿大Regent公司的WinRHIZO根系分析系統(tǒng)。1.3.2煙苗的篩選和噴霧處理將初步篩選出的促生細菌按1.3.1中方法制成菌懸液,種子消毒處理同1.3.1,利用漂浮育苗盤對初步篩選到的促生內(nèi)生細菌進行再次篩選。在煙苗2片真葉時鑒苗,挑選成長整齊一致的的煙草幼苗移栽至漂浮育苗盤,用稀釋10倍的上述菌懸液對煙苗進行噴霧處理,每個處理4株,5次重復,每株噴霧菌液5mL。每隔7d噴霧1次,以等量的無菌水和LB培養(yǎng)液處理作為對照,連續(xù)處理60d,60d后取樣測量煙苗生長形態(tài)指標,最終篩選出煙苗促生細菌。1.4菌體懸浮液處理煙苗將菌株wy2接種于LB培養(yǎng)液中,于28℃、200r/min的搖床中培養(yǎng)48h后,12000r/min離心后分別收集菌體(wy2菌)和上清(wy2),菌體用無菌水洗滌離心兩次后重懸于無菌水中,在600nm處調(diào)整菌懸液光密度為0.5±0.02即為菌體懸浮液。2011年9-10月在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院研和試驗基地采用溫室漂浮育苗方式進行試驗,在煙苗2片真葉時,分別用稀釋10倍后的上清(wy2)及菌體懸浮液(wy2菌)噴霧處理煙苗,每個處理132株煙苗(一盤),2次重復,每盤噴霧200mL。每隔7d噴霧1次,以等量的無菌水和LB培養(yǎng)液處理作為對照,連續(xù)處理60d,分別于第48d、55d、62d取樣測定每株煙草幼苗的莖鮮重、莖粗、莖高、根長。1.5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析采用MicrosoftExcel2003軟件和DPS7.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。1.6enomicna項細菌基因組DNA的提取用TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKit,方法參見試劑盒說明書。PCR擴增選用引物F27/R1492,常規(guī)條件擴增,并用Mega4.0軟件,將該序列與已報道的芽孢桿菌菌株的16SrDNA全序列進行同源性比較,并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。2結果與分析2.1煙草種子萌發(fā)通過在培養(yǎng)皿中進行的發(fā)芽試驗,測定了127株內(nèi)生細菌處理后煙草種子的發(fā)芽率、根長和根體積,淘汰了會不同程度降低煙草種子發(fā)芽率和抑制煙草種子萌發(fā)的菌株,在經(jīng)過重復多次的發(fā)芽試驗后篩選出了4株在不同程度上對煙草有促生性的內(nèi)生細菌。從表1可以看出,水和LB培養(yǎng)液作用于煙草種子,平均發(fā)芽率分別為75.0%和81.7%。煙草種子經(jīng)內(nèi)生細菌cg15、cg16、wy2、wy3處理后,發(fā)芽率、根長和根體積與對照相比均有提高,發(fā)芽率提高了16.3%-20.3%,各菌株之間的差異順序是:cg16>wy2=cg15>wy3。根長提高了25.1%-30.3%,各菌株之間的差異順序是:wy2>cg15=cg16>wy3。根體積提高了50%-100%,各菌株之間的差異順序是:wy2>cg15=wy3>cg16。菌液處理組與對照組差異均達顯著水平。各處理煙草種子萌發(fā)的情況見圖1,可見所有經(jīng)內(nèi)生細菌處理過的煙草種子根長均長于對照,菌液處理組在根的數(shù)量上也明顯高于對照且子葉寬厚、葉色蔥綠。說明cg15、cg16、wy2、wy3不僅能有效促進煙草種子萌發(fā)而且對煙草根系生長也有積極的促進作用。2.2菌液處理對煙苗根系、根長和生物量的影響對培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗初篩得到的4株菌,通過漂浮育苗盤進行了進一步的篩選。參試菌株各項指標的綜合評價見表2,除cg15外其余菌株各項指標的綜合評價均好于清水對照和LB對照,其中以wy2最好,wy3次之,cg16第三。圖2顯示,所有經(jīng)促生細菌處理過的煙苗根長均長于對照,菌液處理組較對照組根系更發(fā)達,而對照組根系長勢較弱,根系不發(fā)達。從對莖直徑的影響來看,wy2、wy3、cg16對莖直徑的影響達顯著水平,分別比LB對照增加了33.3%、17.8%和20.0%,cg15則沒有顯著地促進或抑制效果。從對根長的影響來看,除了cg15處理的根長低于對照組以外,其余菌株處理的煙苗根長較對照均有提高,但除了wy2以外,wy3和cg16處理與對照差異不顯著,經(jīng)wy2處理的煙苗根長比LB對照長出49.2%。從株高、莖鮮重、葉重、最大葉長最大葉寬來看,菌液處理的煙苗各項指標較對照有所提高,但變化不大,總體上與對照無明顯差異。說明菌液處理對地上部分生物量沒有顯著的促進作用,對地下部分生物量有顯著的促進作用。用以上各指標對各菌株的促生性做綜合評價,其中以wy2對煙苗的促生效果最佳,順序是:wy2>wy3>cg16>cg15。2.3菌體懸浮液和發(fā)酵液對煙草莖高、莖重和根長的影響復篩結果表明,wy2對煙草的生長發(fā)育確實有明顯穩(wěn)定的促生作用,為了探究wy2的活性是由什么成分在起作用,是由菌體活細胞還是菌體的胞外分泌物,為此,我們分別用菌體活細胞懸浮液和菌體發(fā)酵液上清噴霧處理煙草漂浮苗,在株齡48d、55d、62d調(diào)查每處理對煙草漂浮苗莖鮮重、莖直徑、莖高和根長的影響。試驗結果如圖3、圖4、圖5、圖6。圖3顯示,菌體活細胞懸浮液在株齡48d和55d對莖鮮重的影響達顯著水平,平均比LB對照增重了0.22g和0.56g,在株齡62d時菌體處理組雖然高于對照組,但與對照無顯著差異。發(fā)酵液上清處理莖鮮重在整個生育期中都與對照無顯著差異。圖4顯示,菌體活細胞懸浮液處理和發(fā)酵液上清處理在株齡48d時對莖直徑的影響達顯著水平,平均比LB對照增粗了0.26mm和0.05mm,而在株齡55d的時候,僅菌體懸浮液處理與LB對照有顯著差異,相比LB對照處理,莖直徑增粗了0.48mm,發(fā)酵液上清處理莖直徑與LB對照無差異。在株齡62d的時候,菌體處理組雖然高于對照組,但與對照無顯著差異。圖5顯示,在株齡48d和55d的時候,菌體懸浮液處理組莖高與LB對照相比差異達顯著水平。莖高平均比對照增加了1.31cm和1.46cm,而發(fā)酵液上清液處理對莖高的影響未達顯著。在株齡62d的時候,兩種處理莖高與LB對照相比差異不顯著。圖6顯示,在株齡48d的時候,菌體懸浮液處理根長與LB對照處理差異顯著,根長平均比LB對照長70.61cm。發(fā)酵液上清液處理根長與LB對照處理差異顯著,與清水對照處理差異不顯著。在株齡55d的時候,菌體懸浮液處理組根長長于LB對照,但差異未達顯著,與清水對照差異顯著。發(fā)酵液上清處理與LB對照差異不顯著。在株齡62d的時候,兩處理與LB對照都無差異。試驗結果表明,菌體活細胞懸浮液對煙苗有比較明顯和相對普遍的促生長作用。尤其是在株齡48d和55d的時候,煙苗的莖鮮重、莖粗、莖高、根長均高于LB對照,且與對照差異顯著。而發(fā)酵液上清液在整個煙草苗床期中對煙苗的生長沒有顯著地影響,其莖鮮重、莖粗、莖高、根長與對照相近或比對照差。說明菌體是對煙草生長發(fā)育有促生作用的活性成分。發(fā)酵液上清液對煙草生長發(fā)育并無促生作用。2.4bacillus屬植物誘導桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析,與其同源性最高的菌為解淀粉芽孢桿菌相似性為99%。在RibosomalDatabase數(shù)據(jù)庫中選取10株屬于Bacillus屬的不同種的芽孢桿菌模式菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹查看屬種間的遺傳進化關系(圖7),從系統(tǒng)發(fā)育樹看,wy11與B.amyloliquefaciens(GU826160)處于同一分支,說明兩者的遺傳進化關系最近,因此將菌株wy2鑒定為B.amyloliquefaciens(JQ936679)。3漂浮育苗試驗的結果分析本研究對127株煙草內(nèi)生細菌進行了培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗,由于試驗初期首先進行了皿內(nèi)促生的濃度梯度預試驗,發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌發(fā)酵液稀釋10倍促生效果最為理想,因此本試驗選用此濃度作為菌株發(fā)酵液的供試濃度。從中選出4個菌株作為重點菌,進一步對這4株菌進行了漂浮育苗試驗復篩,最后挑選出1株對煙草的生長發(fā)育確實有明顯穩(wěn)定的促生作用的細菌wy2,經(jīng)過溫室漂浮育苗試驗的驗證,結果和復篩試驗基本一致,表明通過這種篩選途徑得到的促生菌株是有效的。wy2對煙苗根長的促進作用最為明顯,推斷wy2可能是通過促進根的生長和分節(jié),增大根重,有效提高了幼苗的根系功能,從而更高效的促進煙苗對水分和養(yǎng)分的吸收,進而促進了葉片的光合作用,使得煙苗莖直徑增加,鮮重增加。本文在植物生育前期噴灑wy2菌液后,使苗床期煙苗在苗齡48d和55d時的莖鮮重、莖粗、莖高、根長得到不同程度的提高,這對于促進煙苗的早發(fā)快長是很有意義的。但在苗齡62d的時候,各處理與對照差異不顯著?？赡芤驗榻泳椒ㄋ?葉面噴施促生細菌對煙草植株生態(tài)系的改造可能是暫時的,作用也是有限的,下一步可以探索最合適的接菌方法,以便從微生物角度使煙株長期處于一個最利于發(fā)揮豐產(chǎn)性狀的穩(wěn)定的微生態(tài)系。在試驗過程中,尤其是漂浮育苗試驗,雖然每次結果4個菌株大都比對照有明顯效果,尤其表現(xiàn)在對根長的促生方面,但是,同一菌株在不同試驗地點、時間和試驗次數(shù)中均表現(xiàn)出有一